中性脂质贮积病伴肌病（NLSDM）临床与遗传谱系新探：一例PNPLA2基因新型缺失突变的功能与结构研究

《Journal of Neuromuscular Diseases》：Delving into the clinical and genetic spectrum of NLSDM: A case study

　　

摘要专业翻译 PNPLA2基因编码脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL），该基因突变与中性脂质贮积病伴肌病（NLSDM）相关。这种罕见的遗传性疾病以中性脂质在胞质脂滴（LDs）中的异常积聚为特征，几乎在所有患者中导致肌肉相关症状，如无力、痉挛和进行性肌病，约半数患者伴有心肌病。本研究报告了一例42岁意大利男性NLSDM患者携带的新型PNPLA2变异体及其临床与磁共振成像（MRI）发现，揭示了一种累及四肢近端和远端肌肉、以及轴性和面部肌肉的肌病模式，未检测到心脏异常。基因检测发现一种新的PNPLA2纯合突变，导致第一个ATGL LC3相互作用区域（LIR）基序中单个氨基酸缺失。此外，生物信息学分析预测了突变型ATGL的结构变化，可能影响其酶功能并通过破坏ATGL-LC3相互作用损害脂肪分解和脂噬。蛋白质印迹分析证实了脂噬通路的阻断。本研究拓宽了对NLSDM遗传和临床异质性的理解，强调了该疾病的复杂性。

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研究背景与研究目的

中性脂质贮积病伴肌病（NLSDM）是一种超罕见的常染色体隐性脂质代谢疾病，全球仅诊断132例。该病的病理基础是PNPLA2基因突变导致其编码的脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）功能受损或活性降低。ATGL是催化甘油三酯（TAG）水解起始和限速步骤的关键酶，将其转化为二酰甘油（DAG）和游离脂肪酸。ATGL包含两个主要功能区域：负责酶活性的patatin结构域（含催化二元组S47和D166）和脂质结合疏水结构域。值得注意的是，patatin结构域还含有三个LC3相互作用区域（LIR）基序，这些基序使ATGL能够与自噬蛋白（如LC3）相互作用，促进自噬体向脂滴（LDs）的募集，这一过程称为脂噬——一种特化的自噬形式。

尽管已有72种不同的ATGL编码基因突变被报道，但特定结构区域对疾病发病机制的功能贡献仍不完全清楚，关于单个LIR基序功能作用的实验证据仍然缺乏。本研究旨在通过对一例携带新型PNPLA2纯合框内缺失突变的意大利NLSDM患者进行临床、遗传学和功能分析，探究该突变对ATGL稳定性、脂肪分解和脂噬的影响，从而加深对ATGL结构与功能关系的理解。

研究方法概述

研究人员对一名42岁意大利男性患者进行了详细的临床评估、神经电生理检查和影像学检查，包括骨骼肌MRI。从外周血提取基因组DNA，采用靶向下一代测序（NGS）面板筛查与脂质贮积肌病相关的基因，并通过Sanger测序确认PNPLA2变异。利用I-Tasser软件进行生物信息学结构建模预测突变蛋白的结构变化。从皮肤活检获得患者真皮成纤维细胞进行原代培养，采用尼罗红染色观察脂滴积累。通过蛋白质印迹法检测ATGL、PLIN2、p62和LC3等蛋白的表达水平。为评估应激条件下的自噬反应，对成纤维细胞进行为期四天的血清饥饿处理。

研究结果

病史与临床检查

患者为42岁意大利男性，有4年进行性上肢近端肌无力病史。神经系统检查显示肩带肌群显著受累，双侧肩带肌萎缩伴翼状肩胛，右侧更明显。四肢深腱反射减弱，跟腱反射消失。肌力测试显示肩外展轻至中度无力。可见眼轮匝肌轻度无力。心血管检查正常。

实验室与影像学检查

血清肌酸激酶（CK）水平持续升高至正常上限约3倍（690 U/L和581 U/L）。心电图和24小时动态心电图监测正常。心脏MRI显示极轻微局灶性下外侧壁心肌内纤维化。骨骼肌MRI显示临床受累及看似未受累肌肉均出现异常：双侧冈下肌和冈上肌显著对称性萎缩伴脂肪替代；三角肌前中部中度萎缩伴脂肪浸润；近端椎旁肌中度萎缩和脂肪替代；双侧前锯肌严重萎缩伴广泛脂肪替代；骨盆区右侧臀中肌和臀小肌显著不对称性脂肪替代和萎缩；大腿后部右侧股二头肌和双侧半膜肌远端严重脂肪替代和萎缩；双侧比目鱼肌和腓肠肌中度脂肪替代和萎缩。

组织病理学与分子遗传学

右三角肌活检的苏木精-伊红（H&E）和苏丹黑染色显示肌纤维内脂滴。真皮成纤维细胞的尼罗红染色证实不同组织中异常脂滴积累。外周血粒细胞May-Grünwald-Giemsa（MGG）染色显示Jordan异常——中性脂质贮积病的标志物。基因分析发现PNPLA2基因一个新的纯合缺失（外显子2: c.45_47delCGG），导致ATGL蛋白第一个LIR基序内单个氨基酸框内缺失[ATGL(G16del)]。双亲均为杂合携带者。根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南，该变异被分类为可能致病（ACMG 4级）。

结构建模与功能分析

I-Tasser软件预测突变蛋白二级结构发生改变：第13位从β折叠变为卷曲螺旋，第14、32、34、89和104位从卷曲螺旋变为α螺旋。三维折叠预测显示错误构象。蛋白质印迹分析显示患者成纤维细胞中ATGL蛋白水平显著降低，PLIN2表达增加，p62水平升高而LC3-II减少，表明自噬通量受损和脂噬缺陷。血清饥饿处理后，LC3和p62水平无明显变化，提示自噬反应迟钝。

讨论与结论

本研究首次报道了影响第一个LIR基序的PNPLA2突变与NLSDM相关联。该缺失位于patatin结构域内，该结构域同时含有催化二元组和协调脂肪分解与脂噬的调控元件。结构建模预测G16缺失改变了ATGL折叠，增加了patatin结构域内的α螺旋含量，可能降低蛋白质柔性并干扰酶活性，从而影响脂肪分解和自噬功能。

功能分析支持这一结构预测：ATGL蛋白水平显著降低提示脂肪分解能力受损；PLIN2升高证实脂滴积累；p62升高和LC3-II降低表明自噬通量受损和脂噬缺陷。血清饥饿后自噬标志物无显著变化，进一步证实自噬机制受损，无法对营养剥夺做出适应性反应。

临床上，患者表现为以右侧为主的肌肉受累，MRI显示选择性肌肉受累模式与既往报道一致。值得注意的是，观察到双侧眼轮匝肌轻度无力，呈现面肩肱腓骨肌病样表型，这扩大了NLSDM的临床表现谱。

研究结论：本工作整合性地描述了一个此前未报道的选择性影响ATGL第一个LIR基序的框内缺失。通过结合结构建模和患者成纤维细胞功能分析，证明该LIR基序的破坏与ATGL水平降低和脂噬的组成性损伤相关。这些发现扩展了对ATGL结构与功能关系的现有认识，突出了单个LIR基序在协调脂肪分解和脂噬中的功能相关性。此外，强调需要采取细致入微、以患者为中心的方法，因为仅依赖典型的近端肌肉受累可能不足以捕捉疾病表现的全貌。