《Frontiers in Neurology》：Kainate-induced ATP release contributes to spinal excitotoxicity that is attenuated by purinergic blockade
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## 摘要
**引言：** 严重脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）以不可逆的神经元丢失和永久性运动/感觉功能障碍为特征，目前治疗手段极为有限。本研究旨在评估嘌呤能信号在红藻氨酸（kainate, KA）诱导的局灶性化学损伤后SCI极早
## 摘要
**引言：** 严重脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）以不可逆的神经元丢失和永久性运动/感觉功能障碍为特征，目前治疗手段极为有限。本研究旨在评估嘌呤能信号在红藻氨酸（kainate, KA）诱导的局灶性化学损伤后SCI极早期阶段所发挥的作用。
**方法：** 研究人员使用雄性和雌性C57BL/6J与BALB/c小鼠建立SCI模型。采用实时生物传感器记录技术，在模拟SCI的体外条件下监测脊髓组织的谷氨酸和ATP释放。评估嘌呤能受体表达变化、神经元存活、胶质细胞激活及运动功能，并检测嘌呤能拮抗剂亮蓝G（Brilliant Blue G, BBG）的干预效应。
**结果：** KA处理诱导细胞外谷氨酸和ATP释放显著增加，并显著上调P2X4和P2X7受体的mRNA水平。与仅KA处理的组织相比，BBG处理显著提高了神经元存活率。在该早期阶段未检测到对星形胶质细胞或小胶质细胞激活的影响。在体内实验中，KA显著损害运动功能，而BBG联合处理产生了部分功能恢复。
**讨论：** 这些发现支持早期ATP释放在兴奋性毒性损伤后调节神经元存活中发挥作用，其机制可能通过CREB依赖性信号通路实现。因此，ATP依赖性机制可能代表未来SCI神经保护策略的有前景的靶点。
**图形摘要**
## 论文解读：嘌呤能信号在脊髓损伤早期兴奋性毒性中的作用——从ATP释放到神经保护策略的探索
### 1. 研究背景与科学问题
脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）是一种严重影响患者生活质量的神经系统疾病，主要累及年轻人群，造成损伤平面以下永久性的运动和感觉功能障碍。SCI的病理过程分为原发性损伤和继发性损伤两个阶段：原发性损伤指直接的机械性创伤，导致轴突断裂、挫伤、出血、缺血和组织肿胀；继发性损伤则在时间上紧随其后，通过多种机制显著加剧周围组织的丢失，其中谷氨酸过度释放驱动的兴奋性毒性（excitotoxicity）和以腺苷三磷酸（adenosine triphosphate, ATP）释放为主要触发因素的神经炎症反应起核心作用。ATP稳态的破坏会损害线粒体功能，进一步加剧ATP产生的失调，加速继发性损伤级联反应，放大神经元死亡和组织退行性变。因此，在SCI急性期维持或恢复ATP产生、调节ATP介导的信号通路，可能成为稳定线粒体功能、限制氧化损伤和防止神经元凋亡的关键治疗策略。
在SCI后期炎症微环境中，ATP作为关键细胞外信号分子，通过激活P2受体家族调节多种细胞过程。损伤或应激细胞释放的ATP激活脊髓中的嘌呤能P2X和P2Y受体，参与兴奋性突触后反应，促进持续性痛觉过敏并放大炎症级联反应。然而，嘌呤能信号在SCI极早期阶段的角色尚不完全清楚，特别是ATP与谷氨酸的协同释放及其对神经元存活的时敏性影响缺乏系统研究。
基于上述背景，本研究的主要目的是利用嘌呤能拮抗剂BBG（一种非核苷酸类嘌呤能拮抗剂，主要靶向P2X7受体），阐明急性兴奋性毒性损伤后由嘌呤能受体介导的SCI继发性事件。研究人员假设ATP和谷氨酸的释放是决定神经元存活的时敏性因素，及时拮抗ATP驱动的信号级联可以稳定损伤环境，为选择性嘌呤能调节剂的合理应用提供理论基础。
### 2. 研究内容与主要结论
研究人员通过体外和体内相结合的研究策略，系统探究了KA诱导的化学性脊髓损伤后早期ATP释放的作用。体外实验采用C57BL/6J小鼠胚胎制备器官型脊髓切片培养物，以及新生（出生后0–3天）雄性和雌性BALB/c小鼠分离的完整脊髓制备物，建立KA（100 μM）诱导的兴奋性毒性损伤模型。体内实验则通过成年雄性BALB/c小鼠（8–10周龄）胸椎T10–T12节段脊髓内注射KA（5 mM, 1 μL）建立化学损伤模型。研究使用实时酶联生物传感器技术同步监测谷氨酸和ATP的动态释放，运用实时荧光定量PCR（real-time RT-PCR）检测嘌呤能受体表达变化，通过免疫荧光染色评估神经元存活、胶质细胞激活状态和CREB蛋白的核转位，并采用Basso Mouse Scale（BMS）评分系统评估后肢运动功能。研究结果表明：KA处理诱导细胞外谷氨酸和ATP显著同步释放，并伴随P2X4和P2X7受体mRNA水平的显著上调；BBG处理可有效减少KA诱导的核固缩（pyknosis）和神经元丢失，显示明确的神经营养保护效应；早期阶段未观察到星形胶质细胞（S100β）和小胶质细胞（Iba1）标志物表达的显著变化；体内实验中，KA损伤导致BMS评分显著下降，BBG联合处理组在8天时表现出部分功能恢复。这些发现揭示了嘌呤能信号在SCI早期兴奋性毒性损伤中被低估的贡献。
### 3. 关键技术方法
本研究采用以下核心实验技术：①实时酶联生物传感器（enzyme-based biosensors, Sarissa Biomedical Ltd.）技术，同步记录器官型脊髓切片培养物中谷氨酸和ATP释放的动态变化；②定量实时PCR（quantitative real-time RT-PCR）检测P2X4和P2X7受体的mRNA表达水平，以β-actin作为管家基因，采用比较CT（ΔΔCT）法进行相对定量；③免疫荧光染色结合共聚焦显微镜成像，使用NeuN标记神经元、S100β标记星形胶质细胞、Iba1标记小胶质细胞、CREB抗体检测总CREB蛋白水平，并通过ImageJ软件进行细胞计数和荧光强度定量分析；④BMS开放性场地运动评分系统评估后肢运动功能。研究样本来源包括：C57BL/6J小鼠胚胎（器官型脊髓切片制备）、新生BALB/c小鼠（离体脊髓制备物）和成年雄性BALB/c小鼠（在体损伤模型）。
### 4. 主要研究结果
#### 4.1 KA诱导谷氨酸和ATP的释放以及P2X4和P2X7受体的转录上调
研究人员利用实时生物传感器在器官型脊髓切片培养物中同步监测了KA暴露期间的递质释放。结果显示，100 μM KA处理可同时诱发内源性谷氨酸和ATP的释放，基于校准曲线确定的峰值电流幅度对应细胞外谷氨酸浓度为1.66 ± 0.16 μM，ATP浓度为36.65 ± 11.40 μM。由于ATP与谷氨酸同步释放，研究人员推测嘌呤能信号可能在初始兴奋性毒性刺激中发挥作用并影响神经元存活。RT-PCR分析显示，KA处理后4小时，新生小鼠脊髓制备物中P2X4和P2X7受体的mRNA水平显著升高，证实嘌呤能信号参与KA兴奋性毒性过程。
#### 4.2 BBG保护培养物免受神经元细胞死亡
为研究ATP释放和嘌呤能信号是否调节KA诱导兴奋性毒性损伤中的细胞死亡，研究人员评估了BBG处理对脊髓制备物存活的影响。核固缩分析显示，KA处理导致脊髓背侧和腹侧区域固缩核的百分比显著增加，而KA + BBG联合处理在背侧和腹侧区域均有效阻止了细胞死亡；单独BBG处理不引起该标志物的变化。NeuN阳性神经元计数显示，KA处理后神经元数量显著减少，而BBG联合处理有效保留了神经元数量，表明在兴奋性毒性刺激后，ATP通过嘌呤能受体（至少部分）加剧神经元死亡，而BBG可以拮抗该效应。
#### 4.3 BBG：胶质表型不变但可能通过CREB驱动神经元效应
研究人员检测了KA和BBG处理对胶质细胞标志物的影响。结果显示，在KA处理后早期时间点，星形胶质细胞标志物S100β和小胶质细胞标志物Iba1的荧光强度均未见显著变化，提示早期阶段胶质细胞表型激活不明显。进一步分析发现，KA暴露显著减少了腹侧脊髓区域CREB阳性细胞核的数量，而BBG联合处理显著逆转了这一效应。线扫描荧光强度分析显示，KA处理降低了细胞核内CREB免疫荧光强度（以任意单位表示），而BBG联合处理将CREB核信号恢复至接近对照水平。DAPI染色在各组间未见差异，排除了细胞核数量变化的干扰。这些结果提示BBG可能通过恢复CREB的核转位来发挥神经保护作用。
#### 4.4 BBG治疗后的体内KA兴奋性毒性运动结局
研究人员在成年BALB/c小鼠中建立了体内脊髓内KA注射模型，并通过BMS评分评估后肢运动功能。结果显示，SCI动物在损伤后1天和8天均表现出BMS评分的显著降低，左右后肢均出现明显功能丧失。KA注射后接受BBG处理的动物在8天时的评分与对照组相似；但统计分析未发现KA组与KA + BBG组之间存在显著差异，表明BBG仅提供部分运动功能恢复，这与既往部分研究报告的BBG未能显著改善运动功能的结果一致。
### 5. 讨论与结论总结
讨论部分指出，本研究揭示了KA诱导的兴奋性毒性损伤后，ATP在早期即与谷氨酸同步释放，并通过嘌呤能信号通路影响神经元存活。BBG的非核苷酸类嘌呤能拮抗作用可减少神经元死亡并部分保留CREB核转位，但运动功能恢复有限。研究人员认为，ATP的早期释放是继发性损伤进展的重要但不唯一的因素，CREB可能作为ATP介导兴奋性毒性机制的下游靶点。研究局限性包括：ATP生物传感器无法区分调节性释放与损伤细胞被动泄漏的ATP；体外实验使用的C57BL/6J和BALB/c小鼠与体内实验仅使用BALB/c小鼠之间的遗传背景差异可能影响功能结果的可比性；BBG对电压门控钠通道（voltage-gated sodium channel, Nav）的脱靶效应不能被完全排除；P2X4受体的功能贡献未被直接探索。研究结论总结如下：阐明急性SCI的早期分子和细胞反应对于指导靶向神经保护策略的开发至关重要。本研究提供了临床前证据，表明兴奋性毒性损伤后的早期ATP释放与神经元存活和网络可塑性的变化相关。观察到的CREB依赖性信号通路改变可能代表了与ATP介导的兴奋性毒性损伤相关的细胞反应。然而，CREB依赖性信号与神经元丢失之间的关联并不建立CREB信号在损伤进展中的因果作用。尽管体外和体内结果均令人鼓舞，但仍需进一步研究评估ATP介导信号的调节能否在SCI后提供持续的神经保护。对ATP驱动机制的持续研究可能有助于开发针对SCI相关并发症的靶向治疗策略。
