棕榈酰化相关预后特征预测弥漫性大B细胞淋巴瘤预后及免疫微环境特征

《Frontiers in Immunology》：A palmitoylation-related signature predicts prognosis and immune microenvironment features in diffuse large B-cell lymphoma

　　

**摘要**

**背景：** 弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL）是最常见的侵袭性淋巴瘤，其预后具有高度异质性。棕榈酰化（palmitoylation）作为一种重要的翻译后修饰，已被证实参与肿瘤生物学过程，但其在DLBCL中的作用，尤其是与免疫微环境的关系，仍不清楚。

**方法：** 研究人员从Gene Expression Omnibus数据库获取了706例DLBCL患者的转录组和临床数据。通过差异表达分析和单因素Cox回归分析，筛选出与预后相关的棕榈酰化相关基因。通过比较101种机器学习算法组合，建立最优预后模型，并与临床变量整合构建列线图（nomogram）。采用免疫浸润、免疫功能、免疫检查点及肿瘤免疫功能障碍与排斥（Tumor Immune Dysfunction and Exclusion, TIDE）分析评估肿瘤免疫微环境。进一步采用加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）和孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）鉴定关键基因，并进行实验验证。

**结果：** 研究建立了包含33个基因的棕榈酰化相关特征（palmitoylation-related signature, PRS），并在多个队列中进行了评估。PRS是DLBCL的独立预后因素，且在各数据集中均表现出一致的预后效能。低风险患者表现出更高的免疫细胞浸润和更活跃的免疫功能，而高风险患者则表现出更强的免疫检查点抑制剂治疗应答预测潜力。整合PRS与临床特征的列线图亦显示出良好的预测准确性。此外，研究在DLBCL中鉴定出两种棕榈酰化相关分子亚型，具有不同的转录组特征、生存结局和免疫微环境特征。基于整合WGCNA和MR分析，CEACAM3被确定为首要候选关键基因，功能实验表明，CEACAM3敲低可抑制细胞增殖和侵袭并促进细胞凋亡，而CEACAM3过表达则增强细胞增殖和侵袭、减少凋亡并促进体内肿瘤生长。

**结论：** PRS能够捕获DLBCL的预后异质性和不同的免疫微环境特征。PRS可能为风险分层提供有用工具，CEACAM3可能作为DLBCL的潜在生物标志物和治疗靶点。

# 棕榈酰化相关基因特征在弥漫性大B细胞淋巴瘤预后与免疫微环境中的系统研究解读

## 一、研究背景与意义

弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL）作为非霍奇金淋巴瘤最常见的病理亚型，约占淋巴系统恶性肿瘤的40%，其显著特征为高度异质性的形态学和分子学表现。目前，以R-CHOP方案为代表的化学免疫治疗是DLBCL的标准一线治疗手段，尽管靶向治疗不断取得进展，仍有约30%-40%的患者出现复发，约10%的新诊断患者难以获得有效缓解。这种治疗结局的显著差异与DLBCL的分子异质性密切相关。因此，深入解析其分子异质性对实现精准治疗和改善患者预后至关重要。近年来，基于多基因表达的风险模型已展现出预后评估价值，并为个体化治疗策略提供了可能依据，然而其系统构建、验证和临床转化应用仍十分有限。此外，肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment, TIME）作为肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）的关键组成部分，已被证实可显著影响DLBCL的疾病进展、治疗应答和临床结局，但不同患者间免疫细胞浸润的组成和功能状态差异极大，这种差异如何影响预后和免疫逃逸尚未得到系统阐述。

棕榈酰化是一种广泛存在且动态可逆的翻译后修饰，通过调控关键肿瘤蛋白的膜定位、稳定性和相互作用参与肿瘤的发生发展。已有研究分别在前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、肝细胞癌和胃癌中证实了棕榈酰化相关基因（palmitoylation-related genes, PRGs）在肿瘤增殖、侵袭、化疗耐药以及预后评估中的重要价值。在DLBCL中，棕榈酰化也被发现与肿瘤的发展和耐药机制有关，提示基于PRGs构建风险预测模型具有重要的临床和科学研究意义。然而，PRS在DLBCL中能否用于预后分层，及其与免疫微环境特征的关系，目前仍缺乏系统的报道。基于此，本研究系统探索了PRGs在DLBCL中的表达特征，构建了基于棕榈酰化相关特征的预后预测模型，并通过整合多组学分析和实验验证鉴定潜在的关键靶点，旨在为DLBCL的风险分层和精准治疗提供新的策略。

## 二、研究内容概述

研究人员从Gene Expression Omnibus数据库中收集了GSE56315、GSE10846、GSE11318和GSE53786四个数据集的DLBCL转录组和临床数据。其中GSE56315用于鉴别肿瘤与正常组织间的差异表达基因，GSE10846作为训练队列，GSE11318和GSE53786作为验证队列，共纳入706例生存期超过30天的DLBCL患者。研究者采用非负矩阵分解（non-negative matrix factorization, NMF）聚类鉴定了棕榈酰化相关的分子亚型；通过整合101种机器学习算法组合构建了最优预后模型；结合免疫浸润分析、免疫功能分析、免疫检查点分析及肿瘤免疫功能障碍与排斥（Tumor Immune Dysfunction and Exclusion, TIDE）分析全面评估了免疫微环境特征；进一步应用WGCNA和孟德尔随机化分析，结合体外和体内功能实验，系统鉴定了CEACAM3在DLBCL中的生物学功能和临床价值。

## 三、关键技术方法

本研究在方法学上的核心创新在于整合了多种计算和实验技术。数据来源于Gene Expression Omnibus数据库的四个公开数据集（GSE56315、GSE10846、GSE11318和GSE53786）。首先通过"limma"包进行差异表达分析，然后取差异表达基因与GeneCards数据库检索所得的3,680个PRGs的交集，获得棕榈酰化相关差异表达基因。在模型构建中，系统整合了10种机器学习算法（包括Lasso、Ridge、stepwise Cox、CoxBoost、RSF、Enet、plsRcox、SuperPC、GBM和survival-SVM），生成101种算法组合，以训练和验证队列的平均一致性指数（concordance index, C-index）作为评价指标，筛选出最优模型。此外，利用基因集变异分析（GSVA）、CIBERSORT和ESTIMATE算法评估通路活性和免疫细胞浸润，采用WGCNA识别与风险分组最相关的基因模块，并利用基于eQTL的孟德尔随机化分析评估基因表达与DLBCL风险的潜在因果关系。实验验证部分使用人DLBCL细胞系SU-DHL-4和TMD8，通过CRISPR/Cas9敲低和过表达策略，结合CCK-8增殖实验、Transwell侵袭实验、TUNEL凋亡染色及NPG小鼠皮下异种移植瘤模型进行功能验证。

## 四、研究结果

### 1. 预后相关棕榈酰化基因的鉴定

对GSE56315数据集进行差异表达分析，共鉴定出16,236个DLBCL与正常组织间的差异表达基因，其中8,094个上调、8,142个下调。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示这些基因主要富集于细胞因子介导的信号通路、胶原细胞外基质、细胞间通讯、细胞运动和黏附及信号转导相关通路。将差异表达基因与已知PRG取交集后获得2,111个棕榈酰化相关差异表达基因。在GSE10846训练队列中通过单因素Cox回归分析筛选出99个与总生存期显著相关的预后相关PDGE。

### 2. 弥漫性大B细胞淋巴瘤中棕榈酰化分子亚型的鉴定

基于99个预后相关PDGE的表达矩阵，NMF聚类将DLBCL样本分为C1和C2两个分子亚型。两种亚型具有显著不同的基因表达模式、转录组分布和生存结局，C2亚型患者的总体生存期显著优于C1亚型。GSVA结果显示C1亚型主要富集于致癌信号通路和代谢过程，而C2亚型主要富集于基因组稳定性和适应性免疫应答相关通路。免疫分析显示C2亚型表现出更活跃的免疫浸润状态，共有13种免疫细胞类型在两种亚型间存在显著差异。这些结果表明棕榈酰化相关分子特征与DLBCL的生物学异质性密切相关。

### 3. 棕榈酰化相关预后特征的构建

通过比较101种机器学习模型组合，StepCox[both] + plsRcox组合因在训练集和验证集中取得最高平均C-index而入选最优模型，用于构建包含33个基因的PRS。该模型在训练队列（GSE10846）和两个验证队列（GSE11318和GSE53786）中的C-index分别为0.787、0.729和0.828。根据各队列PRS中位值将患者分为高低风险组，随着PRS升高，死亡事件比例增加，各队列均呈现一致的风险分层效果。

### 4. 预后预测性能的验证

在训练队列中，低风险组的总生存期显著优于高风险组，预测1年、3年和5年总生存期的AUC值分别达到0.826、0.845和0.848。在验证队列中也观察到一致的预后差异和较高的AUC值。与2022至2025年间发表的10个DLBCL预后基因特征及传统国际预后指数（IPI）比较，PRS在同一分析框架下的C-index和AUC值均表现出更优或与之相当的预测性能。

### 5. 列线图的构建

单因素和多因素Cox回归分析证实PRS是DLBCL总生存期的独立预后因素。将PRS与年龄、ECOG评分和分期等临床特征整合构建的列线图，其C-index达到0.805，校准曲线和ROC分析均证实该列线图在预测个体化生存概率方面具有良好的一致性和优于单独使用PRS或临床特征的预后效能。

### 6. 不同风险组的免疫微环境差异

ESTIMATE分析显示低风险组具有更高的基质评分和ESTIMATE评分，提示其肿瘤纯度较低、非肿瘤组分比例较高。33个PRS模型基因与多数免疫细胞的浸润水平显著相关，PRS与8种免疫细胞丰度相关。具体而言，初始B细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、调节性T细胞（Tregs）和NK细胞与PRS呈正相关，而M0巨噬细胞、静息肥大细胞和γδ T细胞与PRS呈负相关。29个免疫相关特征中有14个在两组间存在显著差异，47个免疫检查点基因中有24个在两风险组间差异表达。TIDE分析提示高风险组的TIDE评分较低，预测其免疫逃逸可能性较低，可能对免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor, ICI）治疗有更好的应答潜力，但仍需针对ICI治疗的DLBCL队列作进一步验证。

### 7. 预测药物敏感性分析

基于GDSC数据库预测了198种化合物的半数抑制浓度（IC50）值。结果显示，5-FU、顺铂、达拉非尼、放线菌素D、表柔比星、I_BET_762、伊立替康、来氟米特、司美替尼和替莫唑胺10种化合物在高风险组中预测IC50较低，提示高风险组对这些药物可能更敏感；而达沙替尼、氟达拉滨、依鲁替尼、奈拉滨和萨沃利替尼5种化合物在低风险组中预测IC50较低，提示低风险组对其可能更敏感。所有这些化合物的预测IC50均与PRS评分显著相关。

### 8. WGCNA与孟德尔随机化分析

WGCNA分析共鉴定出10个基因共表达模块，其中蓝色模块与风险分组的相关性最强，被确定为与PRS风险表型最相关的关键模块。基于全血eQTL数据的孟德尔随机化分析初步发现ATP1B1、BRD2、CEACAM3、CFL2、CTSF、FLVCR2、HCK、KSR1、PCCB和TRPM4共10个基因与DLBCL风险存在提示性的潜在因果关联。将WGCNA蓝色模块中的关键基因与MR分析获得的相关基因取交集，CEACAM3被确定为首要候选关键基因，并进入后续功能验证。

### 9. CEACAM3在DLBCL中的功能验证

CEACAM3在DLBCL肿瘤组织中的表达高于正常组织，且高表达与不良预后相关。在5株DLBCL细胞系中，SU-DHL-4具有最高水平的内源性CEACAM3蛋白表达，TMD8则相对较低。在SU-DHL-4细胞中敲低CEACAM3可显著抑制细胞增殖和侵袭能力，并促进细胞凋亡。相反，在TMD8细胞中过表达CEACAM3可增强细胞增殖和侵袭能力，减少细胞凋亡。体内实验中，CEACAM3过表达显著加速了NPG小鼠皮下移植瘤的生长，最终肿瘤体积和重量均显著高于对照组，且移植瘤组织中Ki-67阳性细胞比例显著升高。

## 五、讨论与结论

本研究系统阐明了棕榈酰化相关基因特征与DLBCL的预后和免疫微环境之间的关系。值得关注的是，PRS与M2巨噬细胞和Tregs的浸润水平呈正相关，两种细胞类型均具有明确的免疫抑制功能，提示高PRS患者可能处于一种免疫逃逸的微环境状态；同时PRS与初始B细胞和M1巨噬细胞也呈正相关，这种看似复杂多样的关联提示高PRS可能反映的是一种免疫状态的改变而非免疫浸润程度的简单降低。CEACAM3作为本研究整合WGCNA与MR分析后优先排序的关键候选基因，其功能实验证实其在DLBCL中发挥促肿瘤作用——敲低后可抑制增殖和侵袭并促进凋亡，过表达则促进增殖、侵袭并抑制凋亡、加速体内肿瘤生长，支持其作为DLBCL潜在生物标志物和治疗靶点的价值。

本研究也存在一定局限性。首先，PRS基于回顾性数据构建，需前瞻性队列验证；其次，免疫治疗和药物敏感性相关结果源自计算预测，需在临床治疗队列和实验模型中进一步验证；第三，MR分析基于全血eQTL数据，尚不能完全反映B细胞特异性的调控效应；最后，PRG基因集来源于GeneCards数据库的广泛注释，仍需进一步通过实验验证核心基因的棕榈酰化修饰状态。尽管如此，本研究构建的PRS为DLBCL的风险分层和免疫微环境特征描述提供了系统依据，CEACAM3的功能验证更为DLBCL的靶向治疗提供了新的候选方向。

**结论：** 本研究构建了基于PRGs的DLBCL预后模型，并在多个队列中验证了其预后评估效能。该模型能够有效进行患者风险分层，并在预测药物敏感性和免疫治疗相关特征方面展现出潜在价值。功能实验表明，CEACAM3促进肿瘤细胞的增殖和侵袭、抑制细胞凋亡并增强体内肿瘤生长，支持其作为DLBCL潜在治疗靶点的价值。