一种区分并分离眼部炎症事件中视网膜小胶质细胞与浸润巨噬细胞的方法

《Frontiers in Immunology》：A method for distinguishing and separating retinal microglia from infiltrating macrophages during an ocular inflammatory event

　　

神经免疫反应研究中的一个重大挑战是识别并分离常驻小胶质细胞（microglia, MG）与浸润性骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages）。为此，研究人员探究了Cx3cr1与Ccr2的双重标记是否足以在发生自发性自身免疫性葡萄膜视网膜炎（spontaneous autoimmune uveoretinitis, SAU）的小鼠中区分视网膜小胶质细胞与浸润巨噬细胞；该疾病依赖于循环中的淋巴细胞和抗原提呈细胞浸润至视网膜。将表达红色荧光蛋白（red fluorescent protein, RFP）受Ccr2启动子控制、表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）受Cx3cr1启动子控制的小鼠（Ccr2^RFPCx3cr1^GFP小鼠）与致葡萄膜炎的R161H小鼠品系杂交。研究人员通过眼底镜检查、流式细胞术（flow cytometry）和荧光显微镜分析了R161H^neg × Ccr2^RFP+/-Cx3cr1^GFP+/- F1小鼠（包括接受视神经夹伤以刺激视网膜MG扩增的小鼠）以及R161H^+/- × Ccr2^RFP+/-Cx3cr1^GFP+/- F1小鼠视网膜中表达RFP和GFP的细胞，并通过单细胞RNA测序（single cell RNA sequencing, scRNA-seq）检测视网膜CD45⁺细胞的Ccr2表达。来自对照组和视神经夹伤的R161H^neg × Ccr2^RFP+/-Cx3cr1^GFP+/- F1小鼠视网膜仅含单一CD45⁺细胞群体，该群体表达独特高水平GFP但不含RFP⁺细胞；而R161H^+/- × Ccr2^RFP+/-Cx3cr1^GFP+/- F1小鼠视网膜中，随着葡萄膜视网膜炎进展，GFP^hi细胞以及GFP^negRFP⁺和GFP^lo-medRFP⁺细胞数量不断增加。因此，Ccr2与Cx3cr1的双重标记能够区分视网膜小胶质细胞与浸润免疫细胞，并且由于GFP⁺、RFP⁺和GFP⁺RFP⁺细胞可轻易通过流式细胞术分选，该体系为下游细胞分析提供了分离方法。

论文解读：基于Ccr2^RFPCx3cr1^GFP双报告系统区分视网膜小胶质细胞与浸润巨噬细胞的方法及其应用

一、研究背景与问题

神经免疫反应研究中长期存在的难点在于准确识别并分离组织常驻小胶质细胞（microglia, MG）与浸润性骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages）。视网膜作为中枢神经系统（central nervous system, CNS）的一部分，其常驻MG起源于胚胎卵黄囊祖细胞，在正常生理条件下几乎不依赖于骨髓来源前体细胞的补充。然而，当循环髓系细胞在血-视网膜屏障破坏等病理条件下进入视网膜后，局部微环境会促使这些浸润细胞获得与内源性MG相似的表型和功能，从而进一步增加了二者区分的难度。既往用于识别MG的标志物，如Tmem119和P2ry12，虽然在静息状态下具有较高特异性，但近年研究发现它们在炎症过程中常发生下调，并可在浸润髓系细胞中上调，因此其区分价值受到质疑。鉴于Cx3cr1在CNS中几乎仅表达于MG，而Ccr2则表达于循环髓系细胞和淋巴细胞并介导其向组织浸润，研究人员设想利用Cx3cr1启动子驱动的绿色荧光蛋白（GFP）和Ccr2启动子驱动的红色荧光蛋白（RFP）双重标记，实现对视网膜MG与浸润巨噬细胞的可靠区分和分离。

二、研究内容与结论

研究人员将携带Ccr2^RFP和Cx3cr1^GFP报告基因的双转基因小鼠与致葡萄膜炎的R161H T细胞受体转基因小鼠杂交，产生R161H^neg × Ccr2^RFP+/-Cx3cr1^GFP+/- F1对照小鼠和R161H^+/- × Ccr2^RFP+/-Cx3cr1^GFP+/- F1自发性自身免疫性葡萄膜视网膜炎（spontaneous autoimmune uveoretinitis, SAU）小鼠。通过眼底成像、荧光显微镜、流式细胞术和单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析视网膜CD45⁺细胞，研究人员发现：对照视网膜仅含一种表达高水平GFP的CD45⁺细胞群体（即MG），且几乎检测不到RFP⁺（Ccr2⁺）细胞；在无菌性视神经夹伤（optic nerve crush, ONC）诱导的MG扩增模型中，视网膜同样缺乏Ccr2⁺细胞；而在SAU小鼠视网膜中，随着疾病进展，出现了明显的RFP⁺和GFP^lo-medRFP⁺细胞，这些细胞与独特的GFP^hiMG群体可被流式细胞术清晰区分。由此得出结论：Ccr2与Cx3cr1双重标记可在炎症条件下有效区分视网膜常驻MG与浸润免疫细胞，且GFP⁺、RFP⁺及GFP⁺RFP⁺细胞可简便地通过流式分选获得，从而为后续细胞分析提供有力工具。该研究解决了神经免疫学中一个长期存在的技术难题，为精确解析MG与浸润巨噬细胞在眼部炎症中的各自作用奠定了基础，并对相关疾病的机制研究和治疗策略开发具有重要价值。

三、关键技术与方法

主要技术方法包括：①双转基因报告小鼠体系（Ccr2^RFPCx3cr1^GFP），通过对Ccr2和Cx3cr1基因座进行敲入式报告标记，使Ccr2⁺细胞表达RFP、Cx3cr1⁺细胞表达GFP；②视网膜眼底成像（fundoscopy）和荧光显微镜，用于原位观察GFP和RFP阳性细胞的分布与形态；③流式细胞术，对完整视网膜解离后的CD45⁺细胞进行免疫表型分析，结合CD11b、CD4等标志物确认细胞身份；④单细胞RNA测序（scRNA-seq），对来自对照和SAU小鼠视网膜的CD45⁺细胞进行转录组分析，验证内源性Ccr2表达分布；⑤视神经夹伤（ONC）模型，作为无菌性视网膜炎症损伤模型，用于验证MG扩增不依赖Ccr2⁺细胞浸润。样本来源包括B6/J小鼠、Ccr2^RFPCx3cr1^GFP小鼠（均购自Jackson Laboratories）以及由Rachel Caspi博士提供的R161H转基因小鼠；实验小鼠为R161H杂合子与B6/J或Ccr2^RFPCx3cr1^GFP纯合子交配产生的F1代。

四、研究结果

1. 对照与SAU炎症视网膜的目视比较
眼底镜检查显示，R161H^neg × Ccr2^RFP+/-Cx3cr1^GFP+/- F1对照视网膜中可清晰观察到Cx3cr1驱动的GFP阳性MG，但未检测到Ccr2驱动的RFP阳性细胞。相反，所有发生SAU的小鼠约30日龄起出现RFP⁺和GFP⁺细胞浸润，并随年龄增长而增加，浸润细胞主要分布在血管周围和视神经头区域。

2. 荧光显微镜确认细胞形态与分布
荧光显微镜在50日龄时进一步确认，对照视网膜中GFP⁺细胞呈树枝状形态，符合静息MG特征，且无RFP表达；而SAU视网膜中即使疾病程度较轻（评分=1.0），也含有大量RFP⁺和RFP⁺GFP⁺细胞，同时GFP⁺单阳性细胞呈现出阿米巴样形态，表明常驻MG已对浸润产生反应。

3. 流式细胞术区分MG与浸润细胞
流式细胞术分析显示，对照视网膜CD45⁺细胞中约82.8%为单一GFP^hi群体（即MG），仅极少量（1.1%）Ccr2⁺RFP⁺细胞，且这些RFP⁺细胞主要存在于CD45^hi淋巴细胞群体中。SAU视网膜中，CD45^hi细胞数量呈指数级增加，绝大多数RFP⁺细胞（96.0%）分布于CD45^hi群体，呈RFP⁺GFP^neg或RFP⁺GFP^lo-med表型，经CD11b和CD4染色证实其中既有髓系细胞也有T细胞。尽管部分MG在炎症中CD45表达升高，但仍保持独特的GFP^hi表型，表明GFP^hiRFP^neg可作为MG的可靠标志。

4. 视神经夹伤后视网膜仍无Ccr2⁺细胞
在视神经夹伤（ONC）后第10天，虽然MG出现显著扩增并向受损神经节细胞迁移，但视网膜中始终未检测到Ccr2⁺（RFP⁺）细胞。该结果证实无菌性损伤诱导的MG扩增完全来源于视网膜和视神经的常驻前体细胞，且不诱导视网膜细胞表达Ccr2，进一步支持Ccr2作为浸润细胞标志的有效性。

5. 单细胞RNA测序验证Ccr2表达分布
对未携带报告基因的对照和SAU小鼠视网膜CD45⁺细胞进行scRNA-seq分析，发现对照小鼠中仅在少量T细胞（cluster 1）中检测到Ccr2表达，其他CD45⁺细胞几乎不表达Ccr2；而在SAU小鼠中，Ccr2表达主要见于T细胞和髓系细胞（cluster 2），且在活动期和消退期SAU中广泛表达于大量CD45⁺细胞。这一独立方法进一步验证了报告基因系统观察到的结果：Ccr2在静息视网膜中基本不表达，而在炎症中主要出现在浸润免疫细胞上。

五、讨论与结论总结

研究人员指出，该双报告系统的成功依赖于两个关键特征：MG具有独特的高水平Cx3cr1表达，以及静息视网膜中几乎完全不存在Ccr2⁺细胞。流式细胞术证实静息视网膜中仅有单一GFP⁺群体，且即使在活动性SAU中，GFP表达最高的细胞群始终存在，说明Cx3cr1^hi可稳定标识组织常驻MG。同时，scRNA-seq发现Ccr2在消退期SAU的CD45⁺细胞上仍有显著表达，提示持续Ccr2表达可能参与炎症转归的调控。研究人员也承认，在持续或慢性炎症中，浸润巨噬细胞理论上可能下调Ccr2并上调Cx3cr1至与MG无法区分，但现有数据显示，在临床前期、早期和高峰期炎症中，所有浸润单核细胞均表达Ccr2，且RFP⁺细胞的Cx3cr1表达水平始终低于内源性MG，因此该系统特别适用于从临床前期至炎症高峰阶段的细胞区分。

研究结论：Ccr2^RFPCx3cr1^GFP双报告系统可将视网膜常驻MG（Ccr2^negCx3cr1^hi，即RFP^negGFP^hi）与浸润巨噬细胞/淋巴细胞（RFP⁺GFP^lo-med，或Ccr2关闭后的GFP^lo-med单阳性细胞）明确区分，并通过流式细胞术简便分选。该系统仅需三种荧光标记即可识别目标细胞，同时可留出通道用于额外表型和功能标志物的分析，为深入研究视网膜MG与浸润巨噬细胞在自身免疫性葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变等疾病中的各自作用提供了可靠的工具平台。