受激拉曼散射显微镜揭示神经元凋亡中的分子重塑

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Molecular remodeling in neuronal apoptosis revealed by stimulated Raman scattering microscopy

　　

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  无标记受激拉曼散射（SRS）成像揭示了谷氨酸诱导的神经元 HT22 细胞凋亡。
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  凋亡过程中出现明显的核阶段，其特征是随阶段变化的蛋白质耗竭或富集。
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  凋亡导致广泛的细胞质结构重组和分子重排。
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  多路复用 SRS 成像揭示了凋亡小体内的成分异质性。

引言

凋亡是一种受严格调控的程序性细胞死亡形式，它通过以精确可控的方式选择性清除多余或受损细胞，同时不干扰周围组织，从而在维持稳态方面发挥关键作用。这一过程支撑着诸如组织发育和免疫调节等生理功能，以及对遗传疾病和癌症进展的病理反应 [1], [2], [3]。凋亡细胞表现出标志性特征，如细胞萎缩、染色质凝聚、DNA 断裂、质膜起泡和凋亡小体形成 [1], [2]。越来越多的证据强调了在单细胞水平表征凋亡的重要性，以便早期检测内部信号事件，阐明细胞毒性机制，调控细胞命运，并推进诊断和治疗策略 [4], [5]。为此，迫切需要追踪凋亡过程中细胞结构和分子组成的时空动态。虽然流式细胞术和蛋白质印迹等传统方法提供了宝贵的见解，但这些方法缺乏分辨率，无法在单个细胞水平上监测上述亚细胞过程 [6], [7], [8], [9]。

光学显微镜长期以来一直是研究生物动态的有力手段，能够以亚微米分辨率可视化细胞结构和生物分子分布 [10], [11], [12]。例如，共聚焦荧光（CF）显微镜揭示了染料标记凋亡细胞中的代谢变化和超微结构改变 [13]。然而，CF 成像依赖于外源性荧光探针，将观察限制在特定目标上，同时引入了光损伤、氧化应激和光漂白等挑战，以及对生物功能可能产生的干扰 [14], [15]。这些局限性突显了对高分辨率、无标记光学技术日益增长的需求。

全息层析成像（HT）作为一种光学衍射层析成像技术，是一种有前景的无标记成像模式，通过非破坏性地绘制折射率（RI）分布来可视化亚细胞结构 [16]。其以最小的光毒性实现长期活细胞监测的能力已被证明对于研究形态动态非常有价值，有效解决了与 CF 显微镜相关的局限性 [17], [18]。然而，HT 通常从细胞核和脂滴等特征明确的隔室的参考图像推断细胞器结构和位置 [19], [20]。此外，由于细胞器内折射率变化，其区分生物分子成分的能力具有挑战性，使得准确表征变得困难 [19]。此外，除非从分离的细胞中推导折射率值，否则很难获得可靠的定量信息。

拉曼散射（RS）显微镜通过检测反映关键生物分子（包括蛋白质、核酸和脂质）中化学键振动能量的非弹性光散射，提供了无标记的单细胞成像 [21]。该技术已被广泛用于研究凋亡细胞的生化和生物物理变化 [5], [22], [23], [24], [25], [26]。然而，RS 成像由于拉曼散射截面极低（~10^?29?cm²）而存在固有的微弱信号，导致信噪比差 [24], [27]。这一限制阻碍了对各种凋亡阶段生物学现象的详细成像 [28]。额外的挑战包括由于分子取向、环境影响和荧光背景引起的强度波动，使得难以量化分子浓度 [29], [30]。

受激拉曼散射（SRS）显微镜作为一种相干拉曼技术，通过同步泵浦和斯托克斯光束之间的非线性相互作用放大拉曼信号，克服了 RS 光谱的局限性。当脉冲之间能量差的拍频匹配特定的分子振动频率时，它会诱导分子的相干振动激发，导致高灵敏度的受激泵浦损耗或斯托克斯增益，检测到的 SRS 信号比 RS 获得的信号大几个数量级 [31]。SRS 显微镜实现了更快的成像速度、更高的灵敏度、分子识别以及具有亚微米空间分辨率的定量化学成像 [32], [33], [34], [35]。尽管有了这些进展，SRS 显微镜仍有几项局限性。细胞成分之间的光谱重叠可能会使分子分配复杂化，特别是在化学复杂的环境中 [36]。此外，窄带皮秒激光 SRS 系统（10–20?cm^?1）的光谱分辨率低于 RS，并且低波数振动模式（< 400?cm^?1）通常无法访问 [37]。SRS 仪器需要复杂的激光系统，过量的激发功率可能在生物样品中引起光损伤 [38]。尽管如此，最近的研究利用 SRS 显微镜研究了动态生化过程，包括癌细胞中的代谢重编程和活组织中的实时药物分布 [26], [28], [36], [39], [40], [41], [42]。

对凋亡的相干拉曼研究主要集中在一般的生物分子改变上，如核酸凝聚、蛋白质聚集和脂质积累，而未能完全解析不同凋亡阶段中空间定义的分子动力学 [43], [44]。此外，由于细胞死亡过程中成分的变化，已报告存在分子量化不一致的情况 [5], [23]。值得注意的是，神经元凋亡的高分辨率、无标记光谱分析仍未得到充分探索。

在此，我们采用 SRS 显微镜研究了神经元凋亡背后的空间分辨生物分子动力学。利用谷氨酸（一种强效兴奋性神经递质），我们在小鼠海马神经元 HT22 细胞中触发了凋亡，并揭示了具有明显分子异质性和协调的亚细胞结构重塑的离散凋亡阶段。SRS 成像进一步分辨了蛋白质与脂质比率的阶段特异性变化，揭示了凋亡进展之前未被认识的方面。这些发现深化了我们对凋亡分子架构的理解，并突显了 SRS 显微镜作为探测神经生物学系统中动态亚细胞重塑的强大平台的潜力。

章节摘要

细胞培养

小鼠海马神经元 HT22 细胞购自 Merck（Merck，美国）。细胞在补充有 10% 胎牛血清（FBS，Gibco）和 1% 青霉素 - 链霉素（Gibco）的杜尔贝科改良伊氏培养基（DMEM，Gibco）中培养。细胞在 5% CO₂ 的湿润大气中以 37?°C 培养。所检测的培养物中未检测到支原体感染。对于谷氨酸处理，L-谷氨酸（Sigma Aldrich）在培养基中新鲜稀释，最终浓度范围在

谷氨酸在 HT22 细胞中诱导凋亡

为了评估谷氨酸在 HT22 细胞中诱导的细胞毒性，在 24 小时后使用不同谷氨酸浓度（2–10?mM）处理，通过 MTT 法测定细胞活力。细胞活力呈剂量依赖性下降：2?mM 时为 90.8?±?2.0%，4?mM 时为 53.5?±?0.6%，6?mM 时为 28.6?±?1.1%，8?mM 时为 18.8?±?1.5%，10?mM 时为 16.3?±?1.7%（相对于未处理对照组细胞）（图 1a）。为了检查时间依赖性，细胞暴露于 4?mM 谷氨酸中 6、12 和 24 小时。细胞活力下降至

结论

无标记 SRS 光谱成像提供了神经元凋亡分子架构的有力见解，超越了形态表征。HT22 细胞中的谷氨酸诱导凋亡伴随着标志性的结构变化，包括核断裂、细胞骨架去极化和质膜起泡，以及蛋白质、脂质和核酸的动态重塑。值得注意的是，核蛋白和核酸水平表现出阶段依赖性变化

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能被认为影响了本论文中报告的工作。

致谢

本研究由韩国国家研究基金会（NRF）资助，由韩国科学和信息通信部（MSIT）支持（RS-2024-00355319）；以及 MSIT 资助的 NRF 生物与医疗技术发展项目（RS-2022-NR068424）。SRS 实验使用多路复用多光子分子成像系统（SC242，韩国基础科学研究院）进行。

Min Soo Kang|Myeongji Park|Hoibin Jeong|A. Reum Je|Yang Hoon Huh|Seung-Hae Kwon|Sanghee Nah