《Surface and Interface Analysis》：Coregistration of Multimodal Imaging Mass Spectrometry and Optical Images of Tissue Sections at Single-Cell Resolution
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光学图像中的组织病理学结构与成像质谱（imaging mass spectrometry, IMS）数据集的精确对齐对于提供有意义的生物学解释至关重要。由于样品制备限制、空间分辨率不匹配以及需要精确的物理和计算对齐（尤其是在单细胞水平），将IMS与光学或其他成
光学图像中的组织病理学结构与成像质谱（imaging mass spectrometry, IMS）数据集的精确对齐对于提供有意义的生物学解释至关重要。由于样品制备限制、空间分辨率不匹配以及需要精确的物理和计算对齐（尤其是在单细胞水平），将IMS与光学或其他成像模态整合仍然具有挑战性。本文讨论了在单个组织切片上进行多模态IMS工作流程所面临的挑战，以及使用激光蚀刻基准标记来改善空间配准的方法。对于单细胞分析，研究人员使用了一种开源的深度学习分割工具来定义组织切片中的细胞边界。研究结果表明，虽然连续组织切片可以对齐大范围的组织结构，但无法保持细胞级别的对应关系，从而限制了高分辨率分析。相比之下，使用激光蚀刻基准标记和深度学习分割的同一切片多模态配准，尽管光学图像中的染色质量有所下降，仍实现了单细胞分子成像。这些方法为未来分子病理学和生物标志物发现的进展奠定了基础。
**论文解读：多模态成像质谱与组织学图像的单细胞分辨率配准**
**一、研究背景与问题**
成像质谱（imaging mass spectrometry, IMS）能够绘制组织中生物化学分子的空间分布，是研究疾病相关分子变化的新兴工具。当前领域的主要进展包括：结合互补技术的多模态分析以丰富化学信息、接近单细胞分析的高空间分辨率，以及利用人工智能识别成像数据中的诊断模式。然而，要从多模态单细胞分析中获益，需要在所有成像模态之间进行高精度的图像对齐。图像配准需要将IMS图像坐标通过几何变换（平移、旋转、缩放）映射到光学图像坐标系中。在IMS测量中，每种模态都会引入不同的畸变源，包括投影效应、样品制备伪影和组织表面形貌等。例如，基质辅助激光解吸电离（matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI）适合检测蛋白质、肽段、寡核苷酸和聚糖，而二次离子质谱（secondary ion mass spectrometry, SIMS）可检测代谢物、无机物和小分子，两者均可检测脂质。常用的将组织学图像与IMS数据集关联的方法是对连续组织切片进行染色，但该方法虽能对齐大尺度组织特征（如胼胝体或肿瘤区域），却无法达到精细结构或单细胞水平所需的空间精度。此外，IMS前染色会降低IMS数据质量，而IMS后染色又会影响苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）图像质量。现有的基于基准标记或组织特征的方法（如染料标记、喷墨打印、激光烧灼或溅射坑等）存在标记物仅限于组织边缘、破坏组织区域或精度不足等问题，难以满足单细胞水平配准的需求。
**二、研究目的与创新**
为解决上述挑战，研究人员提出了一种在氧化铟锡（indium tin oxide, ITO）玻璃载玻片上激光蚀刻基准标记的方法，这些标记在SIMS、MALDI和光学图像中均清晰可见。研究人员系统评估了同一组织切片与连续组织切片配准的差异，以及IMS后染色质量下降的问题，并借助开源深度学习分割工具实现了同一切片上的单细胞分子成像。该方法为多模态IMS与组织学的整合提供了可靠的空间参照框架，为分子病理学和生物标志物发现奠定了技术基础。
**三、主要技术方法**
研究使用健康小鼠大脑冠状切片（厚度10 μm）作为样本，分别开展多模态IMS流程（先ToF-SIMS后MALDI-ToF）、仅MALDI流程以及无IMS处理的对照流程。ToF-SIMS分析采用IONTOF SIMS IV仪器，使用25 keV Bi团簇离子源，在静态SIMS条件下进行大面积拼接成像。MALDI成像采用1,5-二氨基萘（DAN）基质升华沉积，在Bruker Ultraflextreme仪器上以35 μm空间分辨率采集质谱数据。光学显微镜获取H&E染色组织的明场图像。配准通过MATLAB控制点选择工具（cpselect）完成，以激光蚀刻的“十”字形标记作为固定参考点。细胞分割采用基于全局优化边界的细胞分割（Cell Segmentation with Globally Optimized Boundaries, CSGO）开源深度学习流水线。染色质量通过光密度（optical density, OD）量化，配准精度通过Jaccard相似性指数评估。
**四、研究结果**
**1. 染色质量分析**
对照组织切片显示预期范围的细胞质染色色调。而经过多模态IMS和仅MALDI处理的切片显示出更暗、更均匀的伊红信号，相邻细胞质结构对比度降低。这种差异染色丧失可能归因于MALDI激光对组织的蚀刻作用以及高真空环境（MALDI约10?1 mbar，ToF-SIMS约10??至10?? mbar）导致的组织脱水和开裂。通过颜色分割分离苏木精和伊红通道后测量OD值，多模态处理组织的平均OD值低于对照，表明染色质量下降。背景区域分析显示，经历SIMS和MALDI的组织出现更多裂纹和物理损伤，仅MALDI处理的损伤程度介于两者之间。
**2. 连续组织切片配准的局限性**
研究人员将多模态IMS图像注册到连续对照切片上，通过比较两切片中分割出的细胞核区域评估配准精度。尽管两切片来自同一组织块的相邻10 μm薄片，但核的位置、间距和几何形态存在显著不匹配。Jaccard相似性指数仅为2.6%，表明细胞级别对齐程度极低，证实连续切片配准不足以支持单细胞空间分析。
**3. 激光蚀刻基准标记辅助的同一切片多模态配准**
研究人员在ITO载玻片上激光蚀刻“十字”形标记图案，每条线长约1.0 mm，中心间距1.5 mm。蚀刻去除了局部ITO涂层，形成隔离区域，这些标记在SIMS图像中表现为电位或形貌差异，在MALDI数据中表现为轻微质量偏移，同时在光学显微镜下清晰可见。利用这些固定参考点，ToF-SIMS离子图像和MALDI-ToF离子图像均被精确配准到H&E染色组织图像上，建立了统一的空间坐标系。研究展示了海马区选定离子（m/z 86.1、184.1、369.3）的SIMS图像、MALDI图像以及H&E图像的融合结果，证明了多模态数据的空间一致性。
**4. 单细胞水平分子成像**
由于IMS后染色质量受限，研究人员采用预训练的CSGO深度学习模型对H&E图像中的细胞边界进行分割。模型在染色退化条件下仍生成了清晰的细胞掩膜，成功分离出单个完整细胞。利用这些掩膜，研究人员从SIMS数据集中提取了每个细胞的离子强度，得到单细胞质谱。以两个代表性细胞为例：细胞3显示较强的m/z 369.3信号（胆固醇碎片），符合白质中富含胆固醇髓鞘的特征；细胞74则显示较高的m/z 86.1和m/z 184.1信号（磷酸胆碱相关脂质碎片），而m/z 369.3信号较弱，符合灰质的分子特征。结果揭示了单细胞水平的分子异质性。
**五、结论与意义**
研究在同一小鼠脑组织切片上完成了ToF-SIMS、MALDI-ToF和H&E组织学的多模态分析。激光蚀刻基准标记提供了稳定的几何参考框架，使同一组织切片的多模态数据能够精确配准。结合基于深度学习的细胞分割，实现了组织切片上的单细胞水平成像质谱分析。该技术整合为更准确的分子病理学、改进的生物标志物发现以及未来单细胞空间组学工作流提供了可行路径。研究结论明确指出，激光蚀刻基准标记和机器学习驱动的细胞分割是克服多模态IMS配准瓶颈的关键手段，有望推动分子病理学向单细胞精度迈进。
