Eggerthella lenta经TLR4依赖性内质网应激通路破坏肠道血管屏障促进结直肠癌肝转移的机制研究

《Cell Discovery》：Eggerthella lenta disrupts the gut vascular barrier to drive colorectal cancer liver metastasis

　　

远处转移是结直肠癌（colorectal cancer, CRC）患者死亡的主要原因，肠道血管屏障（gut vascular barrier, GVB）是肿瘤血行转移的第一道障碍。为探究GVB功能是否受转移相关细菌直接影响，研究人员分析了包含20例健康对照、82例非转移性CRC患者及65例合并肝或肺转移患者在内的两个队列。采用多组学方法（宏基因组测序和单细胞RNA测序）及无菌小鼠模型，对与GVB破坏和转移相关的肠道微生物进行了研究。CRC肝转移患者表现出GVB受损及转移部位细菌定植。在质膜囊泡相关蛋白-1（plasmalemmal vesicle-associated protein-1, PV-1）（一种GVB损伤标志物）表达升高的患者中，Eggerthella lenta富集，且其丰度与转移和复发相关。在体外和体内实验中，E. lenta均可破坏内皮细胞紧密连接和GVB完整性，增强CRC细胞迁移和肝转移。机制上，E. lenta黏附于内皮细胞，通过TLR4依赖性途径激活内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激，促进自噬和凋亡。敲低PERK可减轻ER应激、阻止自噬和凋亡，并下调由E. lenta诱导的ZO-1和Claudin-5表达下调。这些发现凸显了靶向微生物策略及PERK抑制在治疗E. lenta相关CRC转移中的临床潜力。

论文解读：Eggerthella lenta通过破坏肠道血管屏障促进结直肠癌肝转移的机制研究

一、研究背景与问题

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，远处转移是决定患者不良预后的关键因素，其中肝脏是最常见且最重要的转移靶器官。肿瘤细胞穿过血管内皮层进入血液循环是转移级联反应中的早期关键步骤。近年来，肠道血管屏障（gut vascular barrier, GVB）作为位于肠上皮正下方的特化内皮屏障，被证实是调控肠道内容物与血液循环之间物质交换的重要结构，也是肿瘤细胞从原发灶进入门脉循环进而形成肝转移的决定性检查点。GVB完整性对于阻止病理性易位至关重要，其损伤以质膜囊泡相关蛋白-1（PV-1）表达升高为标志，可导致血管通透性增加，不仅促进肿瘤细胞进入门脉循环，还为转移前微环境的形成提供条件。既往研究已证实多种特异性病原菌（如鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌C17、具核梭杆菌）可直接破坏GVB，而另一些共生菌如阿克曼菌可恢复GVB功能。然而，目前尚无研究系统鉴定CRLM患者或严重GVB损伤患者肠道微生物组的核心致病菌，且这些致病菌驱动CRC肝转移的具体分子机制仍不清楚。因此，本研究旨在筛选并鉴定与GVB破坏相关核心肠道微生物，并阐明其促进CRC肝转移的具体作用及机制。

二、研究内容与主要技术方法

研究人员依托复旦大学上海癌症中心（FUSCC）队列，纳入健康对照、非转移CRC患者、CRC肝转移及肺转移患者，采用组织免疫荧光（IF）、16S rDNA染色、荧光原位杂交（FISH）评估GVB损伤状态；通过宏基因组测序和单细胞RNA测序（scRNA-seq）鉴定与GVB损伤相关的肠道菌群；利用抗生素清除小鼠、AOM/DSS CRC模型、原位结直肠癌肝转移模型及无菌小鼠模型进行体内功能验证；结合体外pHIMEC（人原代肠微血管内皮细胞）共培养、内皮通透性测定、肿瘤细胞跨内皮迁移实验、Western blot、流式凋亡检测、透射电镜和扫描电镜等方法，系统解析E. lenta破坏GVB的分子机制，并利用PERK抑制剂GSK2606414验证靶向治疗潜力。

三、主要研究结果

1. CRLM患者存在显著的GVB损伤
对FUSCC训练队列（20例健康对照、80例CRC患者）的FFPE结肠组织进行IF染色发现，CRC患者内皮细胞中PV-1（相对CD34）平均荧光强度显著高于健康对照，且非癌黏膜中PV-1水平也升高。将CRC患者按有无肝转移分组后，CRLM患者PV-1水平显著高于非转移患者，提示CRLM患者存在GVB损伤。

2. 肠道定植菌E. lenta与GVB损伤、肿瘤转移及复发相关
16S rDNA共聚焦染色显示CRLM患者肿瘤组织细菌定植量更高且伴随PV-1升高。按PV-1中位数将患者分为高、低组，宏基因组测序发现PV-1高组粪便α多样性（Chao1指数）显著升高，物种差异分析显示E. lenta和脱硫弧菌属（Desulfovibrio）等丰度显著增加，其中E. lenta丰度最高且与肿瘤血管PV-1表达正相关。E. lenta丰度在TNM III/IV期（尤其IV期肝转移）患者中显著富集；高E. lenta组血管侵犯比例显著升高，且与早期复发率增加显著相关。FISH证实E. lenta侵入CRC组织并常伴随PV-1过表达。

3. 验证队列证实E. lenta流行及其与器官特异性转移的关联
独立验证队列（30例非转移、20例肝转移、17例肺转移CRC患者）中，肝转移和肺转移组肿瘤组织E. lenta水平、内皮PV-1表达和ATF4激活均显著高于非转移组，但肝转移与肺转移亚组间无显著差异（P>0.05），提示E. lenta可能促进总体转移而非特定器官趋向。全队列中E. lenta丰度与血管PV-1表达显著正相关（Pearson r=0.2631, P=0.0315），且高E. lenta组ATF4表达显著升高（P=0.0004）。

4. E. lenta破坏内皮细胞紧密连接并促进CRC细胞跨内皮迁移
体外实验显示，E. lenta与pHIMEC共培养显著减少内皮管形成数量，降低pHIMEC活力（活菌作用，而非热灭活菌或上清液）。E. lenta对pHIMEC的黏附率高达81.2%，扫描电镜证实其以剂量依赖方式牢固黏附于内皮表面。E. lenta处理显著下调pHIMEC中Wnt1和β-catenin mRNA表达，上调PV-1；显著增加HCT-116细胞跨内皮迁移数量及FITC-葡聚糖跨单层通透性，并降低vinculin和ZO-1的荧光强度，表明E. lenta通过破坏内皮紧密连接促进CRC细胞跨内皮迁移。

5. E. lenta在体内破坏GVB并促进CRC肝转移
抗生素清除小鼠经口灌胃E. lenta后，第4周即出现结肠黏膜血管结构损伤、内皮PV-1升高和ZO-1降低；AOM/DSS造模至第20周时，E. lenta组结肠肿瘤中PV-1升高、ZO-1降低，且尾静脉注射FITC-葡聚糖渗漏显著增加。E. lenta处理还显著上调结肠肿瘤中IL-6、TNF-α和CCL-2 mRNA表达。原位CRLM模型中，E. lenta感染显著增加肝转移发生率及肝表面转移灶面积，证明E. lenta可破坏GVB并促进CRC肝转移。

6. E. lenta可能调控肿瘤内皮细胞ER应激和自噬通路
对5例E. lenta阳性与5例阴性CRC组织进行scRNA-seq，共获得97257个高质量细胞，鉴定出11种细胞类型。内皮细胞差异表达基因的GO分析显示，E. lenta阳性组显著富集“内质网应激”“自噬”等生物学过程，提示E. lenta可能通过调控ER应激和自噬通路影响肿瘤内皮细胞。

7. E. lenta表面蛋白经TLR4依赖性信号级联诱导pHIMEC的ER应激
体外实验表明，E. lenta菌体本身可诱导pHIMEC中p-PERK上调和Beclin-1增加，而培养上清液作用微弱，提示表面相关组分介导效应。TLR4特异性抑制剂TAK-242预处理可逆转E. lenta诱导的p-PERK、p-eIF2α表达变化及自噬激活，表明TLR4是关键受体。人CRC组织免疫组化证实E. lenta阳性组织中BiP和p-eIF2α表达显著升高。

8. PERK敲低可保护E. lenta-ER应激通路诱导的GVB损伤和肿瘤转移
Western blot显示E. lenta处理上调pHIMEC中BiP、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、LC3A/B和Beclin-1，下调P62、ZO-1和Claudin-5，并诱导凋亡和自噬体形成。PERK-siRNA敲低可逆转E. lenta诱导的ER应激、自噬/凋亡及相关蛋白表达变化。原位CRLM模型中，E. lenta感染显著增加肝转移负荷、上调内皮PV-1并激活ATF4，而PERK抑制剂GSK2606414共处理可逆转这些效应，单药GSK2606414无显著影响，证明PERK信号是E. lenta诱导转移的关键下游效应分子。

四、讨论与结论

讨论部分指出，既往研究虽已证实部分病原菌可破坏GVB，但未在CRLM患者中系统分析肠道菌群与GVB损伤的关系。本研究首次发现PV-1高表达患者富集E. lenta和脱硫弧菌属，且E. lenta在GVB损伤部位富集，高丰度与晚期分期、血管/神经侵犯及早期复发相关。E. lenta作为一种常见肠道共生菌，在疾病状态下可突破肠道屏障引起菌血症和肠外器官炎症。本研究揭示了一种新的E. lenta致病机制：其通过直接接触血管内皮细胞，经TLR4依赖性ER应激/自噬通路破坏GVB，而非通过经典WNT信号通路，与大肠杆菌C17和具核梭杆菌的机制不同。虽然E. lenta未直接促进肿瘤细胞增殖，但GVB破坏足以增强跨内皮迁移，且静脉转移模型中E. lenta定植在无细菌-肿瘤细胞直接接触情况下仍促进肝转移，提示GVB破坏是核心机制。

研究结论：本研究首次证明E. lenta通过破坏GVB促进CRC肝转移。E. lenta诱导血管内皮细胞发生ER应激和自噬，增加GVB通透性，为CRC细胞提供转移前微环境。E. lenta丰度升高是CRLM患者肠道菌群失调的标志之一。因此，靶向E. lenta或GVB中的ER应激通路可能是预防CRC肝转移的潜在策略。该研究为微生物-宿主互作在CRC转移中的作用提供了新机制见解，并为微生物靶向治疗和PERK抑制剂的临床转化奠定了实验基础。