《European Journal of Lipid Science and Technology》：Multilamellar Ceramide-Based Nanocarriers: Enhanced Skin Barrier Repair Through Synergistic Supplementation and Bioavailability Modulation
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角质层（stratum corneum, SC）中神经酰胺（ceramide）缺乏是慢性炎症性皮肤病（如特应性皮炎）的关键致病因素。传统局部神经酰胺制剂面临稳定性差、SC渗透不足以及单一的“被动补充”机制缺乏对皮肤屏障修复的主动调控等局限性。研究人员开发并表征
角质层（stratum corneum, SC）中神经酰胺（ceramide）缺乏是慢性炎症性皮肤病（如特应性皮炎）的关键致病因素。传统局部神经酰胺制剂面临稳定性差、SC渗透不足以及单一的“被动补充”机制缺乏对皮肤屏障修复的主动调控等局限性。研究人员开发并表征了一种多层层状神经酰胺纳米载体（multilamellar ceramide nanocarrier, MLC）系统，用于增强皮肤递送和对角质形成细胞屏障相关基因表达的主动调控。MLCs采用薄膜水化法制备，并通过动态光散射（dynamic light scattering）、冷冻透射电子显微镜（cryogenic transmission electron microscopy, Cryo-TEM）和高效液相色谱-荷电气溶胶检测器（high-performance liquid chromatography-charged aerosol detection, HPLC-CAD）进行表征。使用Franz扩散池和猪皮肤评估了皮肤渗透和沉积情况。在HaCaT角质形成细胞中，通过CCK-8法和实时定量聚合酶链式反应（real-time PCR, qPCR）评估了神经酰胺合成基因（CERS3和SPTLC2）、表皮分化基因（FLG、IVL、TGM1和AQP3）以及炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-8）的体外生物活性。MLCs的表征结果为：Z-平均粒径137.1 nm（多分散指数PDI 0.399）、多层层状形态以及98.2% ± 1.3%的包封率（encapsulation efficiency, EE）。离体研究表明，与游离神经酰胺相比，MLCs使SC中的神经酰胺沉积增加了3.0倍，并提高了向活性表皮/真皮的递送效率，全身渗透率低于7%。在HaCaT细胞中，0.1%浓度的MLCs上调了CERS3（5.0倍）、SPTLC2（6.2倍）、FLG（4.7倍）、IVL（4.6倍）、TGM1（3.5倍）和AQP3（5.6倍）的表达，并将TNF-α、IL-6和IL-8的表达抑制了70%–85%（与游离神经酰胺相比，p < 0.001）。MLC平台通过高效的神经酰胺递送和主动的基因上调作用修复皮肤屏障，并具有抗炎效果，为神经酰胺缺乏性皮肤提供了一种有前景的治疗策略。实际应用方面：MLC平台为开发下一代皮肤屏障修复产品提供了一种通用且可规模化放大的配方策略。与传统仅补充脂质的神经酰胺制剂不同，MLCs能够主动刺激角质形成细胞上调内源性神经酰胺合成和表皮分化标志物，同时抑制炎症。这种双重机制使得配方师能够在较低活性成分浓度下实现治疗效果，从而降低生产成本并最小化潜在的皮肤刺激性。MLC技术特别适用于针对特应性皮炎、银屑病、干性皮肤和术后皮肤恢复的局部产品。其在4°C下的良好稳定性和高包封率（98.2%）支持工业规模生产并保证批次间质量一致性，有助于从实验室研究向商业护肤品和皮肤病学应用的转化。
一、研究背景与目的
皮肤作为人体与环境的第一道屏障，其最外层角质层（stratum corneum, SC）由角质细胞（“砖块”）和高度有序的层状脂质基质（“灰浆”）构成。神经酰胺（ceramide）占SC总脂质约50%，对维持通透性屏障功能和皮肤水合作用至关重要。然而，在特应性皮炎（atopic dermatitis, AD）、银屑病等慢性炎症性皮肤病中，普遍存在神经酰胺含量减少、长链神经酰胺比例异常等问题，导致经皮水分丢失（transepidermal water loss, TEWL）增加，形成炎症与屏障损伤的恶性循环。
传统外用神经酰胺制剂面临三大瓶颈：一是物理化学稳定性差，活性成分易泄漏或降解；二是难以有效渗透至靶部位——SC的细胞间片层；三是仅依赖被动的“脂质补充”机制，无法主动调节皮肤内源性的再生能力。为此，研究人员假设，合理设计的多层层状神经酰胺纳米载体（multilamellar ceramide nanocarrier, MLC）可通过双重机制超越被动补充的局限：既能作为高效递送载体将神经酰胺转运并沉积于SC，又能通过其仿生组分主动调节角质形成细胞功能，上调内源性屏障相关蛋白的表达。这一“补充加生物调控”的策略旨在同时解决即时脂质缺失和表皮分化与脂质代谢的潜在障碍。
二、主要技术方法
研究人员采用薄膜水化法结合高剪切均质制备MLCs，并进行了全面的理化表征：利用动态光散射（dynamic light scattering, DLS）和电泳光散射测定粒径、多分散指数（polydispersity index, PDI）及Zeta电位；通过冷冻透射电子显微镜（cryogenic transmission electron microscopy, Cryo-TEM）观察形貌；采用超滤离心联合高效液相色谱-荷电气溶胶检测器（high-performance liquid chromatography-charged aerosol detection, HPLC-CAD）测定包封率（encapsulation efficiency, EE）。离体皮肤渗透与沉积实验使用Franz扩散池和猪皮肤进行。体外生物活性评价在HaCaT人永生化角质形成细胞中进行，包括CCK-8法检测细胞毒性，以及实时定量聚合酶链式反应（quantitative real-time PCR, qPCR）和蛋白质免疫印迹（Western blot）检测屏障相关基因和蛋白表达。
三、研究结果
3.1 MLCs的理化性质表征
通过DLS测得MLCs的Z-平均粒径为137.1 nm（PDI 0.399），体积加权平均直径为91.2 nm，表明存在少量较大囊泡。Zeta电位为-5.3 ± 1.0 mV（pH 6.8），绝对值远低于±30 mV的静电稳定阈值，因此胶体稳定性主要依赖于磷脂和Span 80提供的空间位阻稳定。Cryo-TEM图像清晰显示球形、多层同心脂质双层的囊泡结构，粒径范围约30–200 nm，验证了多层层状结构的成功组装。HPLC-CAD分析表明，MLCs对神经酰胺的包封率高达98.2% ± 1.3%，主要神经酰胺种类为Cer C18:3（33.27%）、Cer C18:1（21.35%）和Cer C18:2（15.77%）。
3.2 胶体稳定性
在4°C储存90天后，MLCs的Z-平均粒径（从91.2增至94.5 nm）、PDI（从0.399增至0.412）和EE（从98.2%降至96.2%）变化极小，表现出优异的稳定性。而在25°C储存条件下，粒径显著增大（至118.6 nm）、PDI升高（至0.485），EE明显下降（至87.3%），表明MLCs需冷藏保存。
3.3 离体皮肤渗透与沉积
Franz扩散池实验结果显示，MLCs组24小时累积渗透量（6.80 μg/cm2）较游离神经酰胺组（1.45 μg/cm2）提高4.7倍。在皮肤沉积方面，MLCs使SC中神经酰胺沉积量达到12.5 μg/cm2，是游离组的3.0倍；活性表皮/真皮（viable epidermis/dermis, VED）中的沉积量为6.2 μg/cm2，是游离组的7.8倍；总皮肤沉积量为18.7 μg/cm2，总体提升3.8倍。值得注意的是，MLCs组仅有不到7%的给药剂量进入接收液，证实其主要滞留在皮肤中，全身暴露风险低。
3.4 细胞活力
CCK-8实验表明，在0.01%–1.0%浓度范围内，MLCs和游离神经酰胺均使HaCaT细胞活力保持在89%以上，远高于ISO 10993-5:2009规定的70%细胞毒性阈值，证明两者均具有良好的生物相容性。基于此，后续qPCR实验选用0.01%、0.05%和0.1%三个非细胞毒性浓度。
3.5 定量qPCR分析
qPCR结果显示，MLCs呈浓度依赖性地显著上调神经酰胺合成基因CERS3（最高5.0倍）和SPTLC2（最高6.2倍）、表皮分化标志物FLG（最高4.7倍）、IVL（最高4.6倍）、TGM1（最高3.5倍）和AQP3（最高5.6倍）。同时，MLCs强力抑制促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-8的表达，在0.1%浓度下分别降至对照组的0.17、0.16和0.14倍（即抑制70%–85%）。在所有测试浓度下，MLCs的生物活性均显著强于游离神经酰胺。例如，游离神经酰胺在0.01%最低浓度下未能显著上调FLG和TGM1，而MLCs在所有浓度下均表现出显著效果。
3.6 蛋白质免疫印迹分析
Western blot结果在蛋白水平上验证了qPCR发现：MLCs处理组中FLG、CERS3、SPTLC2和AQP3的蛋白表达显著高于对照组和游离神经酰胺组，同时TNF-α蛋白表达被强力抑制。mRNA与蛋白水平的一致性证实MLCs确实通过转录和翻译层面的基因表达调控发挥屏障修复和抗炎作用。
四、讨论与结论
讨论部分指出，MLCs的成功归因于其多重优势：高包封率源于多层层状结构提供了多个容纳疏水性神经酰胺的脂双层区域；纳米级尺寸有利于通过细胞间途径甚至毛囊途径穿透；其脂质组成（神经酰胺、胆固醇、磷脂）模拟天然SC脂质基质，促进融合与脂质交换；多层层状结构赋予持续释放特性。值得注意的是，尽管MLCs增强了渗透，但接收液中药物量低（约7%），符合局部用药的安全要求。
关于PDI较高（0.399）的问题，研究人员通过延长高剪切均质时间优化了工艺，使优化后制剂的PDI降至0.231，同时保持了相近的粒径和包封率，证明了改善均一性的可行性。
MLCs在基因和蛋白水平的双重调控效应具有重要临床意义：上调CERS3和SPTLC2可刺激内源性神经酰胺合成，从根本上纠正代谢缺陷；上调FLG、IVL、TGM1和AQP3分别促进SC水合、角质包膜形成和水通道功能；强力抑制TNF-α、IL-6和IL-8则切断了炎症与屏障损伤的恶性循环。MLCs比游离神经酰胺更高效的原因包括：载体保护神经酰胺免于降解或结晶、持续释放延长滞留时间、以及脂质组分可能具有内在生物活性产生协同效应。
研究也指出了若干局限性：稳定性评估限于90天且未进行ICH指导原则下的加速试验；未进行流变学表征（影响涂抹性和患者接受度）；因缺乏小角X射线散射（small-angle X-ray scattering, SAXS）设备，未能测定层状重复距离这一关键结构参数。
研究结论：本研究成功开发了一种多层层状神经酰胺纳米载体（MLC）系统，通过协同的双重作用机制实现了优越的皮肤屏障修复。MLC制剂具有优良的理化性质，包括平均粒径137.1 nm、多层层状囊泡形态和高包封率（98.2%），相较于游离神经酰胺，显著增强了神经酰胺向SC（3.0倍）和活性表皮（7.8倍）的递送。更重要的是，除了被动脂质补充外，MLCs还通过上调神经酰胺合成基因（CERS3和SPTLC2）、表皮分化标志物（FLG、IVL、TGM1和AQP3）以及抑制促炎细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-8）达70%–85%来主动调节角质形成细胞功能，所有效果均显著强于游离神经酰胺。这些发现验证了所假设的“补充加生物调控”策略，证明了合理设计的多层层状纳米载体可以同时解决即时脂质缺失以及表皮分化和炎症方面的潜在障碍。因此，MLC平台代表了针对神经酰胺缺乏性疾病（如AD、银屑病和干性皮肤）皮肤屏障修复的一种有前景的治疗方法，值得进一步开展体内研究和临床评估。
