《Microchemical Journal》：Integrated rapid blood lysis for direct DNA release and RNase HII assisted real-time LAMP for one-pot MTHFR C677T SNP genotyping
编辑推荐：
•快速复合裂解缓冲液可在 10 分钟内直接从全血中释放 DNA，无需纯化。•粗裂解液与 LAMP 完全兼容，简化了工作流程并缩短了检测时间。•核糖核酸酶 HII 辅助的 RT-LAMP (RART-LAMP) 系统提高了 SNP 辨别能力和等位基因特异性。•集成工作流程可在
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快速复合裂解缓冲液可在 10 分钟内直接从全血中释放 DNA，无需纯化。
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粗裂解液与 LAMP 完全兼容，简化了工作流程并缩短了检测时间。
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核糖核酸酶 HII 辅助的 RT-LAMP (RART-LAMP) 系统提高了 SNP 辨别能力和等位基因特异性。
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集成工作流程可在 50 分钟内完成 MTHFR C677T 基因分型，性能与 PCR 相当。
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该方法快速、稳健且具有成本效益，显示出对抑制剂的强耐受性和在即时检测 (POCT) 中的应用潜力。
引言
单核苷酸多态性 (SNPs) 是人类基因组中最普遍的遗传变异形式，并作为临床诊断和个性化医学中的重要生物标志物 [1], [2], [3]。其中，亚甲基四氢叶酸还原酶 (MTHFR) C677T 多态性的检测具有显著的临床价值，因为它可以评估叶酸代谢效率和同型半胱氨酸水平，从而有助于心血管疾病、神经管缺陷和某些癌症的风险评估 [4], [5], [6]。此外，C677T 基因分型为预测不良妊娠结局、识别胰岛素抵抗等代谢异常以及指导特定血液疾病的预后提供了关键依据 [7], [8], [9]。因此，准确快速检测 MTHFR C677T SNP 对于临床风险分层、早期预防和个体化治疗决策至关重要 [10], [11]。
尽管其具有临床相关性，但当前的 MTHFR C677T 基因分型方法不适合快速临床应用。常规技术（Sanger 测序、RFLP、RT-PCR）依赖于费力的人工 DNA 纯化，导致周转时间长且对仪器的依赖性高，这与即时检测 (POCT) 的需求相冲突 [12], [13], [14]。虽然纯化可以减轻血液来源物质的抑制作用 [15], [16]，但它涉及多个步骤，延长了检测时间并增加了污染和错误风险，特别是在大规模操作时 [17], [18], [19]。新兴的简化方法减少了程序复杂性，但面临成本高、灵敏度低以及在资源匮乏地区使用受限等局限性 [20]。环介导等温扩增 (LAMP) 是一种在 60–65 °C 下进行的快速、高度特异性的核酸扩增方法，为基因分型提供了实用的 RT-PCR 替代方案 [21], [22], [23]。通过使用针对 4 到 6 个区域的引物，LAMP 无需热循环即可实现扩增 [24], [25]。然而，其在 MTHFR C677T 基因分型中的应用仍受限于对纯化 DNA 的依赖，这抵消了其速度优势 [26], [27], [28]。此外，Bst DNA 聚合酶缺乏 5′到 3′外切酶活性，使得无法使用 TaqMan 水解探针，限制了检测策略 [29], [30], [31]。
已开发了几种探针设计策略用于 LAMP 信号检测。链置换探针通过垫叉介导的结合产生荧光，但需要精确优化以辨别 SNP，且由于靶向环而使引物设计复杂化 [32], [33]。分子信标在结构复杂性和序列依赖性方面面临类似限制 [34]。虽然 PNA 和 LNA 探针具有高灵敏度，但其使用受限于高成本和潜在的聚合酶活性抑制 [35], [36]。CRISPR-Cas 探针提供高特异性，但与 LAMP 的热不兼容性阻碍了单管集成 [37], [38], [39]。因此，迫切需要一种简单、通用且高性能的 LAMP 探针，专门适用于单管反应格式中的 SNP 基因分型 [40], [41]。
为了克服耗时的样本制备瓶颈，我们开发了一种将快速全血复合裂解缓冲液与 LAMP 相结合的新型策略，用于高效的 MTHFR C677T 基因分型。该方法基于系统性优化的裂解系统，可在 10 分钟内直接从全血制备 DNA，同时与常规柱式和磁珠提取方法相比表现出增强的抗抑制物质能力。为了进一步解决 LAMP 中缺乏水解探针兼容性的问题，我们引入了核糖核酸酶 HII 辅助实时 LAMP (RART-LAMP)。探针在 SNP 位点掺入 RNA 碱基，确保只有完全匹配的探针 - 靶标杂化才能激活 RNase HII，从而导致探针切割并产生荧光信号。总体而言，该方法实现了 10 分钟内的快速 DNA 提取和 40 分钟内的基因分型，大幅减少了传统工作流程的时间限制。与 PCR 相比，它实现了明显更短的周转时间，同时保持了相当的准确性。由于其高效性、简单性和成本效益，该策略代表了 SNP 基因分型和即时检测 (POCT) 的一个有前途的平台，促进了精准医学在基层医疗机构的实施。
章节摘要
样本采集
本研究使用的血样来自西南医科大学附属医院。所有样本采集程序均经西南医科大学附属医院伦理委员会批准（批准号 [BY2026084]），并获得了所有供体的知情同意。使用 Sysmex 自动化血液分析仪进行白细胞 (WBC) 计数。此外，血清脂
工作原理
如图 1 所示，使用自配制的复合裂解缓冲液建立了简化的工作流程，可在 10 分钟内从微量全血中快速提取 gDNA。该过程仅涉及短暂的孵育和离心步骤，消除了对常规离心柱或磁珠纯化的需求，从而大大简化了样本制备（图 1A）。提取的 gDNA 直接应用于 RART-LAMP，允许精确的 MTHFR C677T
结论
我们开发了一种基于快速复合裂解缓冲液结合 RART-LAMP 的 MTHFR C677T 基因分型新方法。通过优化快速复合裂解缓冲液的配方，我们实现了 10 分钟内从全血样本中高效提取 gDNA，并且获得的 gDNA 无需纯化即可直接用于 RART-LAMP 扩增。与常规柱式和磁珠提取方法相比，该方法显著减少了
作者贡献声明
李莲：撰写 - 原稿，可视化，概念化。雍齐文：撰写 - 审阅与编辑，可视化。姚娟：撰写 - 审阅与编辑。王文君：撰写 - 审阅与编辑。蒋雅云：撰写 - 审阅与编辑。龙俊荣：撰写 - 审阅与编辑。郭永灿：撰写 - 审阅与编辑，监督，概念化。张张：撰写 - 审阅与编辑，监督，项目管理，形式分析，概念化。
利益冲突声明
作者声明不存在任何已知的竞争经济利益或个人关系，这些关系可能被视为影响本文所述工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（82460414和12561049）、海南省自然科学基金（326MS0404）、海南省卫生健康科技创新联合项目（WSJK2025QN002）、泸州市人民政府与西南医科大学科技战略合作项目（2024LZXNYDJ103）、泸州科技计划（2025MYF040）、大学生创新训练计划，
李莲|雍齐文|姚娟|王文君|蒋雅云|龙俊荣|郭永灿|张张
