《European Journal of Human Genetics》：digitalMLPA EZtec-MS: A new highly multiplexed DNA probe-based technique for neonatal screening
编辑推荐：
新生儿筛查（newborn screening, NBS）是全世界最成功的公共卫生举措之一。目前，筛查项目采用传统的生化检测方法。然而，随着可治疗的新生儿疾病数量增加，但缺乏适合传统NBS检测的代谢标志物，目前正探索使用基于DNA的方法检测更多疾病。
基于D
新生儿筛查（newborn screening, NBS）是全世界最成功的公共卫生举措之一。目前，筛查项目采用传统的生化检测方法。然而，随着可治疗的新生儿疾病数量增加，但缺乏适合传统NBS检测的代谢标志物，目前正探索使用基于DNA的方法检测更多疾病。
基于DNA的检测方法，如用于脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy, SMA）、严重联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency, SCID）和镰状细胞病的qPCR和熔解曲线分析，已成功用于NBS项目。这些靶向检测的数据解读相对简单，且因不涉及个体DNA的测序和存储，隐私和数据存储问题不适用。然而，qPCR无法实现高度多重化，限制了其在基于DNA的NBS中的作用。
DNA测序成本的下降引发了将下一代测序（next generation sequencing, NGS）纳入常规NBS项目的广泛兴趣。这将允许检测许多符合Wilson和Jungner原则但现有技术无法检测的疾病。然而，尽管世界各地进行了大量试点研究探索对所有新生儿进行测序的潜力，但在广泛测序可作为NBS公共卫生环境中一线检测之前，仍有许多技术、伦理和经济问题有待解决。
变异解读是测序表观健康新生儿的主要技术问题。NGS策略产生的大量数据需要谨慎准确的解读，这需要遗传学和生物信息学专业知识，且可能费力耗时。因此，在筛查环境中对NGS数据进行变异解读具有挑战性，是实施的潜在瓶颈。此外，靶向测序在检测拷贝数变异（copy number variants, CNVs）和倒位方面不够准确，对复杂基因组区域和甲基化变化的分析也不理想。除技术挑战外，新生儿测序还引发了关于同意、隐私和基因组数据存储的问题。人们担心这些问题可能影响公众接受度和NBS项目的参与率。最后，尽管NGS成本下降，但其大规模使用仍然过于昂贵，尤其是在菲律宾等中低收入国家。
数字多重连接依赖性探针扩增（digital Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, dMLPA）是一种近期开发的基于探针的技术。由于其靶向策略，数据分析和解读比NGS更容易。其原理基于广泛用于CNV检测、复杂区域分析和印记区域甲基化检测的MLPA方法。MLPA探针由至少两个寡核苷酸组成，它们与变性靶DNA序列上紧邻的位置结合，可检测不同类型的变异。CNVs和单核苷酸变异（single nucleotide variants, SNVs）通过探针与靶序列杂交后连接来检测。探针寡核苷酸连接后，所有探针使用单引物对进行PCR扩增。为检测甲基化变化，在连接反应中加入HhaI酶可检测样本DNA中HhaI位点的甲基化状态。MLPA检测已作为NBS项目中的二级或确认性检测使用。较新的dMLPA技术允许在每个反应中使用超过1000个靶向探针，PCR扩增子通过NGS定量。在dMLPA中，探针扩增子被测序，仅获得靶向遗传变异的状态，大大减少了意义未明变异或偶然发现的检出，且不产生大量需存储的数据。
在本研究中，研究人员旨在验证新开发的dMLPA EZtec-MS检测方法，该方法针对由不同类型遗传畸变引起且可能与NBS相关的一系列疾病。该dMLPA EZtec-MS技术针对干血斑（dried blot spots, DBS）粗提物进行了优化，与现有dMLPA技术相比工作流程更简化。研究人员使用已知遗传畸变的DNA样本作为阳性对照（n = 86），并检测了来自菲律宾的2069份筛查阴性DBS样本，以评估dMLPA EZtec-MS技术及EZtec-MS检测中所含探针组在NBS环境中的适用性。
基于dMLPA EZtec-MS的新生儿筛查技术验证与多类型遗传变异检测能力研究解读
一、研究背景与问题
新生儿筛查（newborn screening, NBS）作为全球最成功的公共卫生举措之一，传统上依赖生化检测方法。然而，随着可治疗新生儿疾病数量的持续增长，许多疾病缺乏适合传统NBS的代谢标志物，推动了基于DNA检测方法的探索。qPCR和熔解曲线分析已成功应用于脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy, SMA）、严重联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency, SCID）和镰状细胞病等的NBS项目中，这些靶向检测方法数据解读相对简单，但因不涉及个体DNA测序和存储，隐私和数据存储问题较少。然而，qPCR无法实现高度多重化，限制了其在基于DNA的NBS中的进一步应用。
下一代测序（next generation sequencing, NGS）成本的下降引发了将其纳入常规NBS的广泛兴趣，理论上可检测许多符合Wilson和Jungner原则但现有技术无法检测的疾病。然而，NGS在NBS公共卫生环境中的应用面临多重挑战：变异解读需要专业遗传学和生物信息学知识，耗时费力，成为实施瓶颈；靶向测序对拷贝数变异（copy number variants, CNVs）和倒位检测准确性不足，复杂基因组区域分析和甲基化变化检测效果不理想；新生儿测序引发知情同意、隐私和基因组数据存储等伦理问题；此外，尽管测序成本下降，大规模使用在中低收入国家仍然过于昂贵。因此，亟需一种兼具高通量、高多重性、数据解读简便、成本可控且适合NBS环境的DNA检测新技术。
数字多重连接依赖性探针扩增（digital Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, dMLPA）作为一种新型基于探针的技术，因靶向策略使数据分析和解读较NGS更为简便。其原理基于广泛用于CNV检测、复杂区域分析和印记区域甲基化检测的MLPA方法。dMLPA技术允许每个反应使用超过1000个靶向探针，PCR扩增子通过NGS定量，仅获取靶向遗传变异的状态，显著减少意义未明变异和偶然发现的检出，且不产生大量需存储的数据。在此基础上，研究人员开发了针对干血斑（dried blot spots, DBS）粗提物优化的dMLPA EZtec-MS技术，旨在验证其作为NBS一线检测工具的可行性。
二、研究目的与样本来源
本研究旨在验证新开发的dMLPA EZtec-MS检测方法，该方法针对由不同类型遗传畸变引起且可能与NBS相关的疾病。研究使用已知遗传畸变的DNA样本作为阳性对照（n = 86），包括来自Coriell医学研究所或英国国家生物标准与控制研究所（NIBSC）的细胞系来源DNA（n = 62）、合成阳性样本（n = 13）、以及由塞尔维亚母婴保健研究所医学遗传学实验室提供的F8基因确认变异个体血液来源DNA（n = 11）。此外，研究检测了2023年6月至7月在菲律宾马尼拉国立卫生研究院新生儿筛查中心收集的2069份匿名筛查阴性新生儿DBS样本，这些样本对菲律宾新生儿筛查项目检测的29种疾病均呈阴性。
三、关键技术方法
研究人员采用了以下主要技术方法：（1）dMLPA EZtec-MS技术：基于dMLPA原理，使用384（4×96）种独特条形码，通过可破碎PCR板预混合干燥条形码溶液、探针寡核苷酸和杂交缓冲液，简化流程，消除两个移液步骤；（2）DNA提取：使用新开发的SALSA Sample Solution 1试剂从单个3 mm DBS打孔片中提取粗DNA，无需纯化；（3）多重探针检测体系：包含CNV检测探针、SNV特异性探针、甲基化特异性探针（通过HhaI酶消化检测甲基化状态）、以及针对TRECs和巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）等低拷贝数序列的定量探针；（4）NGS定量：PCR扩增子经Illumina NextSeq1000平台测序（110 nt单读长），通过独特分子标识符和参考探针进行数据归一化分析。
四、研究结果
（一）dMLPA EZtec-MS技术在DBS提取物检测中的稳健性
研究人员使用EZtec-MS检测方法检测了2069名新生儿单个3 mm DBS打孔片的粗提物。基于每个探针所含的独特分子标识符，每个DBS打孔片提取的平均DNA总量估计为160 ng（范围约60至约300 ng），每个反应仅使用7 μl提取物（平均19 ng）。所有2069份DBS样本的反应均具有足够的DNA量（>5 ng）和测序深度（>600 reads），参考CNV探针比值的标准偏差低于中位值的10%。在EZtec-MS和EZtec随访检测对DBS提取物进行的4138次反应中，50次（1.2%）因质控探针结果而重复，所有重复反应均通过质控，表明检测失败可能源于移液错误或预混液混合不充分，而非样本质量问题。
（二）阳性样本和2069份菲律宾新生儿样本的检测
为验证SNV特异性探针，研究人员检测了来自细胞系或血液的SNV阳性DNA样本及合成阳性DNA样本。EZtec-MS和EZtec随访检测正确检出了所有阳性样本中的SNV（86/86；95% CI: 95.8–100%），表明100%的敏感性和特异性。
（三）复杂SMN1/SMN2基因座拷贝数变化的检测
为筛查SMA相关遗传变异，EZtec-MS检测包含靶向复杂SMN1/SMN2基因座的探针。SMN1拷贝数由靶向SMN1基因外显子7的单一探针确定，SMN2拷贝数通过五个同时检测SMN1和SMN2的外显子7-8探针的中位信号减去SMN1拷贝数计算。所有细胞系来源阳性样本的拷贝数均正确判定。在2069份DBS样本中，未检出纯合SMN1缺失；13份样本的探针比值在0.45至0.58之间，符合单拷贝SMN1基因，被鉴定为可能的SMA携带者；151名新生儿检出SMN1重复；6名新生儿具有四个基因拷贝。SMN2拷贝数范围为0至4，多数个体（n = 1295）具有两个拷贝。
（四）复杂HBA1/HBA2基因座拷贝数变化的检测
为检测α-地中海贫血相关遗传变异，EZtec-MS检测包含了覆盖复杂HBA基因座的广泛探针组，可区分各种类型的拷贝数变化并检测东南亚人群中常见的致病SNV（如αCS和αQS）。该探针组包含五个同时检测HBA1和HBA2的探针，这五个探针的中位比值确定HBA1+HBA2总拷贝数。已知HBA缺失的细胞系来源纯化DNA样本结果显示这些探针按预期工作。在2069份DBS样本中，研究人员鉴定了137份样本（6.6%）存在HBA拷贝数变化：检出导致HBA1+HBA2总拷贝数为2的大片段缺失（如--SEA和--FIL，n = 53）、导致拷贝数为3的小片段缺失（-α3.7和-α4.2，n = 75）、以及导致拷贝数为5的相互重复（杂合，n = 9）。
（五）FMR1基因拷贝数和甲基化状态检测
为筛查X染色体单体的Fragile X综合征，检测包含五个靶向FMR1外显子1的甲基化特异性探针。在大CGG重复扩增情况下，该区域发生甲基化，HhaI消化后探针信号持续存在。细胞系来源男性样本中，大CGG扩增样本的探针信号为0.30–0.33；七个CGG重复数最多120次的细胞系未检出FMR1甲基化，而五个重复数为570–940次的细胞系显示明显的FMR1启动子甲基化。在1061份具有单条X染色体的DBS样本中，所有FMR1探针中位比值均低于0.05（平均0.01），未检出FMR1甲基化阳性的新生儿。
（六）印记区域拷贝数状态和异常甲基化检测
对于两个印记区域（15q11 Prader-Willi综合征（PWS）/Angelman综合征（AS）/dup15q11综合征和11p15 Beckwith-Wiedemann综合征（BWS）/Silver-Russell综合征（SRS）），检测同时包含CNV探针（无HhaI消化位点）和甲基化特异性探针（含HhaI位点）。15q11区域包含五个甲基化特异性探针和十五个CNV探针。细胞系来源样本的CNV和SNRPN印记区域甲基化状态结果与这些样本的已知描述一致，证明这些探针能够识别由UPD和缺失导致的PWS和AS。在2069份DBS样本中，未检出致病性15q11拷贝数变化。一份样本在SNRPN 15q11区域显示异常结果：SNRPN拷贝数正常，但所有SNRPN甲基化特异性探针信号降低至0.6。值得注意的是，该样本在KCNQ1OT1印记区域（与BWS IC2相关）也有类似结果，提示可能存在嵌合多基因座印记干扰（multi-locus imprinting disturbance, MLID）。
（七）基因组DNA中SNV的检测
EZtec-MS检测包含许多针对选定临床相关SNV的探针。对于与胱氨酸病相关的CTNS基因，包含21个SNV特异性探针。在2069份DBS样本中，未检出CTNS SNV，但一份样本显示整个CTNS基因的杂合缺失，五份样本显示CTNS基因部分重复。EZtec随访检测额外包含11个CTNS SNV探针，但未检出阳性样本。对于与Wilson病相关的ATP7B基因，EZtec-MS检测测试了60个SNV特异性探针，在2069份DBS样本中检出六份样本各自携带不同的ATP7B杂合变异（c.51+4A>T, c.2621C>T, c.2804C>T, c.2930C>T, c.3443T>C和c.4022G>A）。EZtec随访检测额外测试了40个ATP7B SNV，检出一份样本携带杂合变异（c.2304dupC）。
（八）线粒体DNA中SNV的检测
检测包含多个线粒体DNA变异探针，其中有三个线粒体RNR1基因SNV（m.1095T>C, m.1494C>T和m.1555A>G），这些变异在幼儿接受氨基糖苷类抗生素治疗时可导致耳聋。在2069份DBS样本中，八份样本检出m.1555A>G变异，对应频率为1:259。阳性样本经EZtec随访检测中野生型序列（m.1555A）探针测试，显示探针信号几乎完全缺失，表明大多数至可能所有线粒体DNA分子均含有m.1555A>G变异。此外，各检出一份m.14484T>C变异（与Leber遗传性视神经病变（LHON）相关）和m.3243A>G变异（与糖尿病和耳聋相关）样本。
（九）F8倒位检测
研究人员开发了特异性检测F8基因两个常见内含子22倒位和一个罕见内含子1倒位的探针，断裂点位于长重复DNA序列中。探针组还包含相应野生型序列探针和全部26个F8外显子的拷贝数变化探针。11份来自确认有倒位、缺失和重复个体的血液来源样本结果一致。在2069份DBS样本中，检出一名女性携带完整的F8基因缺失。
（十）低拷贝数序列检测
为筛查SCID，检测包含15个TREC探针，用于检测T细胞受体（T cell receptor, TCR）α基因切除重排后产生的信号连接和编码连接。由于阳性对照稀缺，未获得阳性对照，但2069份样本的检测结果显示所有样本的TREC归一化读数和呈正态分布。所有样本的TREC结果均高于0.01背景信号阈值。尽管TREC探针信号较低，两个独立实验中相同DBS样本的结果显示出高相关性（Pearson r = 0.941）。为筛查先天性CMV感染，开发了78个CMV特异性探针。人工阳性样本测试显示除六个探针外均显示强信号，探针信号缺失可能归因于不同CMV株的遗传多样性。在2069份DBS样本中，15份样本的CMV信号增加（10–100求和CMV读数，n = 10；100至>300求和CMV读数，n = 5），明显高于背景，提示潜在CMV感染。每份DBS样本在两个独立实验中测试，结果可重复（Pearson r = 0.986）。
五、讨论与结论
讨论部分指出，dMLPA EZtec-MS技术在阳性样本和2069份DBS样本中的验证结果表明，该技术和所测试的探针组可作为新生儿筛查的一线检测工具，具有高度敏感性和特异性、高通量（每次NGS运行可检测384份样本）、适用于无需DNA纯化的DBS样本以及相对较短的36–40小时周转时间。研究中检出的菲律宾新生儿SMA携带者频率为1:162，与亚洲人群1000基因组计划数据相近；HBA拷贝数变化频率为6.8%；m.1555A>G变异频率为1:259，与韩国人群报道的1:250相近；CMV感染疑似率为0.85%，与先天性CMV总体患病率0.67%相符。研究还检出FMR1启动子甲基化、SNRPN和KCNQ1OT1印记区域异常甲基化、F8基因完整缺失及多种SNV。
研究结论指出，EZtec-MS检测在单次反应中成功检测了CNVs（包括复杂基因组区域基因）、甲基化变化、SNVs、已知倒位和低拷贝数序列。作为基于探针的DNA技术，dMLPA技术减少了NGS引发的伦理和实践问题，因为意义未明变异和偶然发现的检出有限，且不产生大量基因组数据。研究范围仅限于验证EZtec-MS方法用于新生儿疾病筛查，不建议所有纳入当前EZtec-MS检测的疾病都应纳入国家NBS项目。纳入NBS项目的疾病应基于既定筛查标准和各国现有项目范围，通过修改探针混合物内容可轻松调整不同国家包含的疾病。分析软件允许掩蔽选定结果。EZtec-MS检测也可作为新生儿测序策略的补充，用于检测大多数新生儿测序策略经常遗漏的CMV、SMA、SCID、F8倒位、FMR1甲基化和印记障碍。最后，通过dMLPA EZtec-MS进行DNA分析可逐步扩展NBS项目，纳入符合所有标准但缺乏合适血液代谢标志物的疾病，并可补充或替代部分现有NBS检测。
