引言
近年来，不孕不育症的发病率持续上升，生殖病理衰老与生育需求之间的矛盾日益凸显（Rebar, 2009, Chon et al., 2021, Verrilli, 2023, Nash and Davies, 2024）。早发性卵巢功能不全（POF）是女性生殖衰老的一种代表性疾病（Rebar, 2009, Chon et al., 2021, Verrilli, 2023, Nash and Davies, 2024）。其临床定义为：40岁以下女性出现卵巢储备下降、卵泡数量减少并伴有卵子质量下降、月经紊乱（如闭经或月经稀发）、不孕症以及促性腺激素水平升高〔外周血卵泡刺激素（FSH）> 40 U/L〕（Rebar, 2009, Chon et al., 2021, Verrilli, 2023, Nash and Davies, 2024）。POF的发病机制高度复杂，且病程迁延。越来越多的证据表明，遗传易感性、感染、免疫失调、化学放射治疗毒性、心理压力、内分泌紊乱、慢性炎症、环境暴露以及肠道菌群失调等均参与其发病过程（Rebar, 2009, Chon et al., 2021, Verrilli, 2023, Nash and Davies, 2024）。
目前，卵巢颗粒细胞（OGCs）的衰老和凋亡已被广泛认为是卵泡闭锁和POF的关键驱动因素（Liu et al., 2021a, Liu et al., 2024, Liu et al., 2021b）；然而，其底层的分子调控机制仍知之甚少。阐明OGC衰老的调控机制对于维持女性生殖能力具有关键意义。越来越多的证据表明，microRNAs在表观遗传水平上调控OGC衰老、凋亡和细胞周期阻滞中发挥着重要作用（Liu et al., 2021a, Liu et al., 2024, Geng et al., 2022, Nouri et al., 2022, Kuang et al., 2014, Dang et al., 2015）。Dang等人首次报道了140例POF患者外周血循环microRNA的差异表达，并发现与健康对照组相比，miR-22–3p显著下调（Dang et al., 2015）。此外，miR-22–3p表达降低与卵巢储备下降及POF临床表现显著相关（Dang et al., 2015）。随后，miR-15、miR-23a、miR-146、miR-144–5p和microRNA-3061等多种microRNA已被证实可通过调控颗粒细胞衰老和凋亡，在小鼠模型中促进POF的发生和发展（Liu et al., 2021a, Liu et al., 2024, Liu et al., 2021b, Geng et al., 2022）。这些发现凸显了microRNAs在调控OGC功能中的关键作用；然而，其精确的调控网络和机制仍有待深入阐明。
另一方面，抗衰老因子Klotho与POF的发生密切相关（Kuro, 2019, Edmonston et al., 2024, Luo et al., 2023, Lai et al., 2021, Liu et al., 2019）。α-Klotho蛋白由Klotho（KL）基因编码，在肾脏、脉络丛和卵巢组织中高度表达，在调节磷酸盐、钙和维生素D代谢中发挥关键作用（Kuro, 2019, Edmonston et al., 2024, Luo et al., 2023, Lai et al., 2021, Liu et al., 2019）。KL基因产生三种主要形式：全长跨膜Klotho、截短可溶性Klotho和分泌型Klotho（sKL）（Kuro, 2019, Edmonston et al., 2024, Luo et al., 2023, Lai et al., 2021, Liu et al., 2019）。在小鼠模型中，KL过表达可延长寿命，而基因敲除则加速衰老并显著缩短生存期（Kuro, 2019, Edmonston et al., 2024, Luo et al., 2023, Lai et al., 2021, Liu et al., 2019）。具体而言，小鼠和人类循环中sKL水平随衰老而下降，且sKL已被证实可抑制转化生长因子β1诱导的Wnt/β-catenin信号通路以及胰岛素样生长因子1介导的纤维化通路（Kuro, 2019, Edmonston et al., 2024, Luo et al., 2023, Lai et al., 2021, Liu et al., 2019）。一致地，KL–/–小鼠表现出生长迟缓、骨质疏松、异位钙化、组织早衰以及约9周龄时早期死亡（Kuro, 2019, Edmonston et al., 2024, Luo et al., 2023, Lai et al., 2021, Liu et al., 2019）。近期研究进一步表明，内源性α-Klotho表达降低损害OGCs的自噬活性和活性氧清除能力，最终导致POF的发生。这些发现凸显了Klotho缺失与POF之间的强关联性；然而，其底层的分子机制仍有待阐明。
基于上述证据，本研究构建了OGC特异性microRNA基因敲入转基因小鼠，并通过体内和体外方法证明，microRNA 322（miR-322–5p）直接靶向并抑制Klotho的表达。这一调控导致小鼠OGC发生细胞周期阻滞并加速衰老，从而促进POF的发生，揭示了卵巢衰老的一种新的表观遗传调控机制。
