通过CRISPR干扰和纳米孔直接RNA测序探究大肠杆菌表观转录组

《MicrobiologyOpen》：Interrogating the Escherichia coli Epitranscriptome Via CRISPR Interference and Nanopore Native RNA Sequencing

　　

表观转录组学（epitranscriptomics）近年来因技术进步和转化应用而获得了显著发展；然而，关于细菌RNA修饰的研究仍然有限。细菌RNA极易降解，且研究表观转录组的方法学具有挑战性。先前研究表明，RNA修饰可调节抗菌药物耐药性、毒力和致病性。本研究采用CRISPR干扰（CRISPR interference，CRISPRi）在三种大肠杆菌（Escherichia coli）菌株中敲低五个已知的rRNA修饰基因（rlmF、rlmJ、rluD、rsmF和rsmG）。研究人员对这些分离株进行了生长延迟、蛋白质组变化以及通过天然RNA测序（native RNA sequencing）检测mRNA修饰影响的研究。CRISPRi有效沉默了E. coli中大多数RNA修饰基因（>80%的降低）。与rlmF、rluD和rsmF的抑制相关的显著生长延迟被观察到。针对rlmJ（TreB、XylF）、rluD（CysH、HycB、PutP、TrpB）、rsmF（EvgA）和rsmG（OppC）发现了与RNA修饰缺失对应的独特蛋白质通路。通过分析纳米孔电信号检测到了rluD（Ψ）和rsmG（m⁷G）的已知rRNA修饰位点；然而，对于m⁶A（rlmF、rlmJ）和m⁵C（rsmF）修饰仅观察到弱信号。rRNA修饰的抑制导致mRNA修饰变化，包括ompC、cspC、dbhA、dbhB和secY基因。研究人员的工作提供了一种解析E. coli表观转录组以深入了解其功能作用的方法。

表观转录组学（epitranscriptomics）研究RNA转录后修饰的谱图与功能，近年来因测序技术进步而受到广泛关注。然而，细菌RNA修饰研究仍较为有限。细菌RNA极易降解，且传统检测方法需要高纯度、高浓度的目标RNA，限制了多类型修饰和多种RNA的同时检测。已知RNA修饰可调节细菌的抗菌药物耐药性、毒力和致病性，因此深入研究细菌表观转录组具有重要生物学意义。目前，利用纳米孔直接RNA测序（native RNA sequencing）研究细菌RNA修饰的工作大多集中于核糖体RNA（rRNA），对信使RNA（mRNA）修饰的认知仍然匮乏。为此，研究人员开展了本研究，旨在利用CRISPR干扰（CRISPR interference，CRISPRi）结合纳米孔直接RNA测序，系统解析大肠杆菌（Escherichia coli）表观转录组，并探究rRNA修饰基因敲低对细菌生长、蛋白质组和mRNA修饰的影响。

研究人员选用来自美国典型培养物保藏中心（ATCC）的三株大肠杆菌（ATCC 11775、ATCC 8739、ATCC 25922），利用携带诱导型dCas9的pFD152质粒系统进行CRISPRi敲低，通过qRT-PCR验证基因表达下调；采用生长曲线评估生长表型；运用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行蛋白质组分析；采用牛津纳米孔技术（ONT）直接RNA测序（包括Flongle和GridION平台），并使用Nanocompore软件分析电信号差异以识别RNA修饰位点。

### 3.1 RNA修饰基因表达与敲低效率

研究人员通过qRT-PCR检测了五个已知rRNA修饰基因及add在四株大肠杆菌中的表达，所有基因均有表达。在ATCC 11775中测试了两个gRNA，除rsmG仅降低约54%外，大多数基因敲低效率均≥80%。ATCC 25922和ATCC 8739也实现了有效敲低，而ATCC BAA-2452因质粒适应性问题未能成功转化。该结果表明CRISPRi可高效沉默E. coli中的rRNA修饰基因。

### 3.2 CRISPRi对细菌生长的影响

生长曲线显示，激活dCas9对ATCC 11775和ATCC 8739的生长影响不同。在ATCC 11775中，空载体对照已表现出明显生长代价；与对照相比，rluD和rsmF抑制导致显著生长延迟。在ATCC 8739中，rlmF、rluD和rsmF抑制也显著延缓生长。这说明特定rRNA修饰基因的缺失可对细菌生长产生负面影响。

### 3.3 受影响的独特蛋白质通路

蛋白质组分析共检测到数千个蛋白。在滤除dCas9自身影响后，多个蛋白变化在至少两个菌株中一致：rlmJ敲低导致海藻糖PTS系统IIBC组分（TreB）减少和木糖结合蛋白F（XylF）增加；rluD敲低导致CysH、PutP、TrpB增加及HycB减少；rsmF敲低导致EvgA减少；rsmG敲低导致OppC增加。这些结果表明rRNA修饰缺失会引发特定蛋白质通路的改变。

### 3.4 通过直接RNA测序检测已知rRNA修饰位点

研究人员利用Flongle和GridION进行直接RNA测序，并通过Nanocompore分析电信号。结果显示，rluD对应的Ψ位点（23S rRNA 1911/1915/1917）和rsmG对应的m⁷G位点（16S rRNA 527）均能在两种测序平台中被检测到，验证了该技术检测已知rRNA修饰的可行性。

### 3.5 rRNA位点检测水平取决于靶基因和修饰类型

对于rlmF和rlmJ对应的m⁶A位点以及rsmF对应的m⁵C位点，信号较弱且难以从噪声中区分；而Ψ和m⁷G信号较强。这表明不同RNA修饰类型的检测灵敏度存在差异，部分修饰仍需改进分析方法。

### 3.6 mRNA修饰位点的检测

通过统一基因注释并比较敲低与对照样本，研究人员在mRNA上发现了多个显著变化的修饰位点，涉及ompC、cspC、dbhA、dbhB、secY等基因。对于rluD和rsmG，还在mRNA上检测到与已知rRNA基序相似的位置，例如rluD在tuf1/tuf2、lpp1、gapA、fusA中，rsmG在hupA、lpp1、rplT、rpsA、ompC中。这说明rRNA修饰基因的抑制可影响mRNA的修饰状态。

讨论部分指出，CRISPRi虽能有效敲低基因，但存在PAM位点限制、操纵子效应及质粒负担等局限。生长延迟和蛋白质组变化与菌株背景及实验设计相关，部分结果需进一步验证。直接RNA测序对m⁶A和m⁵C的检测仍具挑战，且生长条件会影响修饰检测。研究结论可翻译为：总的来说，新一代直接RNA测序的出现有望快速检测RNA修饰。然而，针对不同细菌物种的mRNA修饰检测，包括修饰类型及其在特定生长条件下的动态变化，仍需进一步优化。这种精细化的检测将有助于全面理解细菌mRNA修饰在抗菌药物耐药性、毒力和致病性中的作用。