《Molecular Ecology Resources》：Comparing the Performance of Double-Stranded and Single-Stranded DNA Libraries for Ancient Oral Microbiome Reconstruction
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DNA文库构建方法可影响古代DNA（ancient DNA, aDNA）的回收效率，进而影响下游分析。尽管已有研究表明，单链文库制备（single-stranded library preparation, ssLib）在处理高度降解的脊椎动物宿主DNA时优于
DNA文库构建方法可影响古代DNA（ancient DNA, aDNA）的回收效率，进而影响下游分析。尽管已有研究表明，单链文库制备（single-stranded library preparation, ssLib）在处理高度降解的脊椎动物宿主DNA时优于双链文库制备（double-stranded library preparation, dsLib），尤其是对距今超过40,000年的样本，但关于文库方案如何塑造古代微生物群落重建的研究仍较少。本研究比较了由12例尼安德特人（Neanderthal）和2例铜石并用时代（Chalcolithic）人类样本制备的配对ssLib与dsLib牙结石（dental calculus）文库的测序输出，文库分别采用Gansauge等人及Meyer和Kircher方案的优化版本构建，并使用相同的Illumina化学试剂进行测序。研究人员比较了不同归一化策略下的读长与GC含量、重复率及分类学谱，以评估方案特异性偏差。双链文库在整个数据处理过程中保留了显著更高比例的测序读段（dsLib 72.1%，ssLib 37.9%），口腔来源读段比例更高（dsLib 9.78%，ssLib 6.75%），口腔DNA读段中位长度显著更长（dsLib 57.5 bp，ssLib 50.5 bp），且富集更多GC含量高的片段（dsLib GC含量60.5%，ssLib 52.5%）。相比之下，ssLib表现出略高的Shannon多样性指数和更高比例的唯一读段。尽管存在这些差异，两种方案在物种丰富度和总体群落组成上并无显著差异，个体和保存状态解释了最大比例的变异。按读长分层（<50 bp vs. ≥50 bp）会导致不同的分类注释率，但对多样性估计影响较小。综上，这些结果表明dsLib和ssLib方案具有不同的权衡，文库选择应依据具体研究目标而定。
论文解读
一、研究背景与科学问题
古代DNA（ancient DNA, aDNA）研究使科学家得以重建过去动物、植物和微生物的基因组图景。然而，aDNA面临死后损伤累积的挑战，包括DNA片段化导致分子长度缩短，以及胞嘧啶脱氨导致的末端错义病变积累。过去二十年间，样本处理设施、DNA提取方法和文库构建方案的改进大幅提升了aDNA的回收质量与数量，但这些优化工作主要聚焦于脊椎动物宿主DNA，对古代微生物DNA——尤其是宿主微生物组等复杂微生物群落——的回收尚未得到同等程度的测试与优化。
生物遗存中初始细胞密度和底物结构差异显著，影响可回收的宿主DNA与微生物DNA总量。骨骼组织中脊椎动物宿主DNA含量通常极低（<2 ng/mg），而牙结石（calcified dental plaque）和古粪便等次级底物中的复杂微生物群落可产生高得多的DNA量。此外，骨骼组织的高孔隙率使环境微生物在腐烂和埋藏过程中大量侵入，导致回收DNA中很大一部分来源于环境微生物。对于以微生物为对象的研究，由于起始微生物生物量较高，核心挑战在于如何区分古代微生物与死后定植菌，这高度依赖于可靠的分类学归属。
脊椎动物宿主研究可借助单一、注释完善的参考基因组进行读段比对，即使较短的损伤片段也可被可靠分配。相比之下，微生物研究需比对包含数千个分类群的庞大而异质的参考数据库，分类学评估强烈受DNA片段化影响。短于30 bp的读段通常因缺乏分类特异性而被丢弃，30至50 bp的读段也可能缺乏可靠微生物分类所需的分辨率。此外，短读段还会引入分类偏差，尤其是对GC含量可变或具有大附属基因组的物种。因此，与宿主研究不同，混合微生物群落的微生物古基因组学研究需要更长的读段以实现足够的分类分辨率和基因组重建。
由于超短DNA在宿主古基因组学中丰富且仍有信息价值，方法学创新主要集中于最大化回收极短DNA片段。在文库制备中，双链DNA文库（dsLib）虽仍可与标准商业Illumina流程相当，但古基因组学已日益采用单链文库（ssLib）方法，后者能更高效地捕获高度片段化的分子。Meyer和Kircher（2010）的dsLib方案通过平末端修复和双链接头连接，但平末端连接是非定向的，约50%的DNA分子因接头组合不兼容而丢失，且该方法对未修复缺口高度敏感，进一步造成下游损失。ssLib方案（Gansauge等）通过热变性将所有输入分子转为单链形式，连接生物素化接头并固定在链霉亲和素磁珠上，避免了缺口问题，最大限度减少了纯化过程中的DNA损失，已被证明能高效回收短、损伤的内源DNA片段，尤其适用于超过40,000年的样本。
然而，文库方案优化在微生物古基因组学中带来重要实际问题。ssLib回收的aDNA虽多，但这些以超短读段为主的数据能否有效用于微生物宏基因组分析尚不明确。相反，dsLib包含较长DNA，但制备过程可能导致大量分子损失，可能改变回收物种的相对丰度和组成。因此，文库选择可能不仅影响总DNA产量，还影响古代微生物组样本的分类学谱。此外，参考数据库不完整以及对宏基因组组装基因组（metagenome-assembled genomes, MAGs）依赖的日益增加，更需要足够读长以进行准确组装。目前，使用ssLib的古代微生物组研究相对较少，两种文库策略孰优孰劣尚不清楚。近期一项针对约4000–7500年前六个牙结石样本的研究发现，样本保存状态显著影响各方案的有效性，且没有任何一种文库方案在所有评估指标上优于另一种。更大规模、时间跨度更长的研究有待开展。
牙结石是评估文库制备策略对古代微生物群重建性能的理想体系：它在深时尺度上保存口腔微生物组，每个样本通常包含约50–200个口腔物种，在现代和古代背景下均已得到充分表征，且覆盖广泛的保存状态。本研究利用12例尼安德特人（约43,000–102,000 BP）和2例铜石并用时代人类（约4200 BP）的牙结石样本，对ssLib和dsLib制备方案进行了系统比较，旨在理解文库方案如何影响古代宏基因组分析的多个阶段，包括文库读段复杂性和污染、读段加工与保留、片段长度与GC含量，以及推断微生物群落的α多样性和β多样性。
二、主要关键技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法：（1）样本来源于12例已发表的尼安德特人牙结石样本和2例未发表的铜石并用时代人类牙结石样本，前者来自西班牙、塞尔维亚、意大利和比利时的多个遗址，后者来自西班牙Camino del Molino遗址。（2）dsLib文库按Meyer和Kircher（2010）方案的优化版本（Aron, Neumann等优化；Stahl等索引）构建，ssLib文库按Gansauge等（2017, 2020）方案的自动化版本（Nagel等优化）构建，所有文库均未进行尿嘧啶-DNA糖基化酶（uracil-DNA glycosylase, UDG）处理。（3）测序在Illumina NextSeq 500和HiSeq 4000平台进行，采用双端75 bp化学。（4）数据处理使用nf-core/eager流程v2.4.6，包括FastQC质量检查、AdapterRemoval适配器去除与读段合并及质量过滤（去除<30 bp读段）、比对人类基因组及人工制品序列去除、Cutadapt进一步清理。（5）分类学注释使用Kraken2 v2.1.2，基于GTDB r207数据库，置信度阈值0.15，随后使用decontam去除实验室和环境污染物。（6）采用Nonpareil评估文库复杂度，使用SourceTracker和累积百分比衰减曲线（cuperdec）评估样本保存状态和污染来源，使用Wilcoxon符号秩检验进行配对比较。
三、主要研究结果
3.1 初始测序：测序深度在样本间存在显著差异。dsLib中位测序深度为16,016,533读段对，ssLib为25,618,848读段对，部分dsLib（GOY005、GOY006、PES001）超过5000万读段对。为控制测序深度影响，研究采用两种归一化策略：处理前归一化至1000万读段对（NPre）和处理后归一化至500万读段（NPost）。
3.2 文库复杂度：Nonpareil分析显示，dsLib的估计平均宏基因组覆盖率始终高于ssLib，表明dsLib的测序深度更早接近饱和，序列冗余度更高。
3.3 污染谱：SourceTracker口腔来源比例在两种文库方案间无显著差异（p=0.715），表明文库方案不系统性影响口腔保存状态的评估。14个起始样本中，5个样本（BAN001、FUM003、GUE001、SPM002、ZAF001）在两种文库方案中均表现为保存较差。
3.4 文库类型对读段处理结果的影响：在NPre数据集中，dsLib在每一步处理后的读段保留率均显著高于ssLib（p=0.0001），dsLib平均保留72.1%读段，ssLib仅保留37.9%。dsLib处理后片段中位长度显著更长（58 bp vs. 43 bp），GC含量显著更高（60% vs. 51%）。ssLib读段损失主要发生在去除<30 bp读段步骤，该步骤ssLib损失56.8%读段，而dsLib仅损失10.4%。适配器二聚体来源读段仅占合并读段的0.1%–3%，说明ssLib损失的是真实超短DNA插入片段而非接头二聚体。
3.5 口腔微生物组多样性和组成分析：在NPost数据集中，dsLib回收的口腔来源读段比例显著更高（9.78% vs. 6.75%），口腔读段显著更长（57.5 bp vs. 50.5 bp）且GC含量更高（60.5% vs. 52.5%）。物种丰富度方面，两种方案无显著差异（dsLib平均177种，ssLib平均181种口腔物种）。Shannon多样性在NPost ssLib中显著更高（3.35 vs. 3.09），但差异较小。β多样性分析显示，样本主要按个体聚类而非按文库方案聚类，保存状态不显著结构化口腔群落组成。
3.6 基于读长的分类学差异：对ssLib而言，按<50 bp和≥50 bp分层后α多样性无显著差异。对dsLib，在NPre数据集中≥50 bp读段回收的口腔物种显著多于<50 bp读段（155 vs. 132），但NPost数据集中差异不显著。Shannon多样性在两种读长分层间均无显著差异。PCA显示个体间分离仍大于文库方案或读长分层导致的分离。
3.7 口腔物种水平驱动因素：在仅保留保存良好样本的子集中，个体解释了98.6%的方差（PERMANOVA R2=0.986），文库方案解释的方差很小（R2=0.012）。物种负载分析显示，dsLib对同一物种通常回收更长、GC含量更高的片段；ssLib对低GC物种（如Methanocatella oralis、Aggregatibacter kilianii）的回收相对改善，主要通过增加较短片段丰度。所有分析物种均呈现典型aDNA损伤模式。
3.8 克隆性：NPost数据集中，dsLib平均86.9%的唯一口腔读段，ssLib为95.4%（p=0.027）。dsLib中重复读段大部分（90.3%）仅为单次重复，说明克隆程度不严重。克隆性在样本间差异较大，表明该效应具有样本依赖性。
四、讨论与结论
讨论部分指出，dsLib和ssLib方案在读段回收和分类学谱上存在明显权衡：dsLib提高了读段回收率、分类物种数和片段长度，而ssLib保留了更高比例的唯一读段且保留了更短的AT富集片段。GC含量差异是最一致的读段水平模式，dsLib富集GC含量高的片段，这可能与AT富集片段热稳定性较低、更易发生链分离和损伤有关。物种水平分析表明，这种模式并非简单地由dsLib优先回收高GC物种所驱动，而是对同一物种dsLib回收更长、GC含量更高的片段。与参考基因组比较还发现，无论文库类型如何，古代样本的GC含量偏离参考基因组中位值的趋势并非单一方向，提示还需进一步研究测序偏差对特定物种保留的影响。
尽管存在读段水平差异，个体差异和保存状态解释了文库样本间的大部分变异，文库方案未覆盖潜在的生物学信号。因此，文库方案选择应依据研究目标：当需要最大化读长和可识别口腔读段数量时（如宏基因组组装），dsLib可能更具优势；对于高度降解的样本，ssLib有利于短片段回收。重要的是，两种文库可以在同一研究中直接比较而不会引入主要的群落组成偏差。未来研究应关注其他方法学变量（如DNA提取方法、聚合酶、UDG处理策略）的系统评估，并建议采用相同输入体积以排除分子输入量差异的影响。
研究结论为：尽管dsLib和ssLib在aDNA回收机制上存在根本差异，但没有一种方案在各项指标上持续优于另一种。dsLib在处理过程中保留更高比例的读段、回收更长且GC更富集的片段、产生更多分类读段和口腔读段，而ssLib产生更高比例的唯一读段并保留更短的AT富集片段。然而，这些方案依赖的差异并未显著影响总体分类学丰富度，也未掩盖主导的生物学或埋藏学信号。因此，文库选择应依据研究目标和样本背景而定。这一发现直接回应了微生物古基因组学中以往优先回收超短DNA片段的方法学挑战：ssLib增加的短损伤读段回收并不一定转化为微生物群落分类分辨率的提高，而dsLib中较长的片段也未造成群落组成的显著分化。总体而言，dsLib和ssLib可在同一研究中直接比较而不引入重大群落组成偏差，但持续的方法学改进和跨样本系统比较对于稳健重建古代微生物生态系统仍十分必要。
