《The Plant Genome》：A pangenome-based approach reveals genes associated with polyploidy and apomixis in Eragrostis curvula
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Eragrostis curvula是一种牧草物种，其中存在多种细胞型（cytotype），且在有性生殖与无融合生殖（apomixis）之间的转换十分常见。本研究考察了这些细胞型之间与倍性水平和生殖模式相关的遗传变异。为此，研究人员组建了一个包含多种种质（ac
Eragrostis curvula是一种牧草物种，其中存在多种细胞型（cytotype），且在有性生殖与无融合生殖（apomixis）之间的转换十分常见。本研究考察了这些细胞型之间与倍性水平和生殖模式相关的遗传变异。为此，研究人员组建了一个包含多种种质（accession）的小组，以捕获该物种的种内多样性。利用该小组，通过迭代比对Illumina短读段（short reads）并对未比对读段进行从头组装（de novo assembly），构建了基于全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）的线性泛基因组（pangenome），从而扩展了现有的参考基因组并改善了该物种基因池（gene pool）的代表性。随后，该小组及所得泛基因组被用于基因含量检测、功能注释和变异检测。利用该方法，研究人员在E. curvula各品种间观察到广泛的基因含量变异，其中多倍体细胞型所含的新组装泛基因组序列比例高于二倍体。此外，还鉴定了与多倍化（polyploidization）和无融合生殖相关的候选基因。与多倍体相关的基因主要涉及细胞周期调控和DNA复制，而与无融合生殖相关的基因则主要涉及转录后调控。此外，研究人员还推断了各细胞型之间的系统发育关系，等位基因频率（allele frequency, AF）分布揭示了与倍性相关的品种间差异。因此，本研究鉴定了与多倍性和无融合生殖相关的候选基因，突显了与倍性相关的基因含量变化及转录后调控过程，并为理解多倍化和生殖模式转换如何塑造这一无融合生殖禾草物种的基因组进化提供了见解。
**一、研究背景与科学问题**
Eragrostis curvula（垂穗草）是禾本科（Poaceae）中一种多年生C4牧草，因其耐旱性和在贫瘠土壤中的适应能力而被广泛引种用于牧草生产和土壤保持。该物种在分类学上属于多系起源的Eragrostis属，种内存在多种细胞型（cytotype），其倍性水平从二倍体（2x）到八倍体（8x）不等。在自然群体中，二倍体细胞型均为有性生殖，而大多数多倍体（4x–8x）通过无融合生殖（apomixis）进行克隆种子繁殖，其中多数为兼性无融合生殖，即可在同一植株内同时产生合子胚和克隆种子。多倍化与无融合生殖在被子植物中的频繁关联是一个长期未解的核心问题：这两种性状究竟由何种遗传机制连接，其分子基础尚不清楚。
此前，E. curvula已完成高质量二倍体品种Victoria（2x，有性）的参考基因组组装，并基于Victoria和四倍体无融合品种Tanganyika INTA构建了双品种泛基因组。然而，仅基于两个品种的泛基因组无法充分捕获该物种丰富的种内遗传多样性，尤其是不同倍性和生殖模式细胞型之间的基因含量差异。此外，单参考基因组在检测物种内全部遗传变异方面存在固有的偏差，难以全面反映基因存在/缺失变异（presence/absence variation, PAV）。因此，利用多品种策略构建涵盖不同倍性和生殖模式的泛基因组，是系统研究该物种遗传多样性和鉴定多倍化与无融合生殖候选基因的必要途径。
**二、研究内容与主要结论**
为系统解决上述问题，研究人员从CERZOS-CONICET种质资源库中选取了12个E. curvula品种，涵盖二倍体（2x）至七倍体（7x）的倍性范围和从专性有性到专性无融合的生殖模式范围。通过流式细胞术验证各品种的倍性水平后，基于已发表的Victoria参考基因组，采用迭代映射与组装（iterative mapping and assembly）策略，利用10个品种的Illumina双端短读段（2×150 bp）构建了线性泛基因组。该泛基因组最终大小约为895 Mb，N50为23.8 Mb，相较Victoria参考基因组的603 Mb显著扩展，新增约296 Mb序列。BUSCO评估显示泛基因组完整度为95.7%，基因注释共获得97,082个基因模型，几乎是Victoria参考基因组（56,469个）的两倍。
基于该泛基因组，研究人员进行了基因PAV检测，发现69,438个核心基因（core genes）和27,644个可变基因（variable genes）。统计分析表明，基因数量随倍性水平升高而显著增加，线性回归显示倍性与基因数呈显著正相关（R2 = 0.88，p < 0.00001）。通过严格的集合交集分析，研究人员鉴定了582个多倍体相关基因（在全部二倍体中缺失且在所有多倍体中存在）和406个无融合生殖相关基因（在所有无融合品种中存在且在所有有性品种中缺失），这两个基因集互不重叠。基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析显示，多倍体相关基因主要富集于细胞周期调控（G2/M期转换）、着丝粒/纺锤体功能、DNA复制等生物学过程，其中包含A型细胞周期蛋白（CycA2）、驱动蛋白（KIN-7）和复制蛋白A亚基（RPA2）等；无融合生殖相关基因则显著富集于RNA加工和剪接体相关功能，特别是催化性剪接体步骤1和步骤2复合体及U2型剪接体复合体，核心基因包括CWC22样pre-mRNA剪接因子。转录因子（TF）/转录调控因子（TR）分析进一步揭示，FAR1、B3和TRAF家族在两类基因集中均有分布，而AP2/ERF、MYB和NAC家族仅出现于无融合生殖相关基因中，C2C2-Dof、C2H2、LOB/LBD、PLATZ和ZF-HD家族则仅出现于多倍体相关基因中。体外RT-PCR验证了无融合特异基因PVA31样基因仅在无融合品种中表达，计算机模拟PCR则确认了此前报道的EcAPO1–EcAPO4引物靶标分别落入无融合相关或多倍体相关基因集。全基因组单核苷酸多态性（SNP）分析共鉴定出约4700万个双等位SNP，经中性位点和连锁不平衡过滤后保留1,696,724个SNP用于系统发育网络构建，Neighbor-Net网络和主成分分析（PCA）揭示了品种间的遗传关系。SNP杂合度分析和等位基因频率（AF）分布显示，多倍体品种的SNP-call杂合度（31.69%–33.49%）显著高于二倍体（6.57%–9.61%），AF分布谱在不同倍性间呈现不同的峰型特征，表明不同四倍体品种可能具有不同的基因组行为（如类自多倍体或类异多倍体模式）。
**三、关键技术方法**
研究人员在构建泛基因组过程中主要采用了以下关键技术：①迭代映射与组装策略，即依次将每个品种的Illumina读段比对到当前参考序列，提取未比对读段用MaSuRCA进行从头组装，再将新组装序列整合进逐步扩展的泛基因组中（共10轮迭代）；②基于MAKER软件的基因注释流程，整合了来自Eragrostis tef和多个多倍体品种花组织的RNA-Seq转录本证据作为训练和验证数据；③利用SGSGeneLoss软件进行基因PAV检测，结合Venn图集合运算定义多倍体相关和无融合生殖相关基因集；④采用GATK Best Practices流程进行SNP/InDel变异检测，经严格过滤后进行系统发育网络和等位基因频率分析；⑤以定性RT-PCR和计算机模拟PCR（in silico PCR）对PAV预测结果进行体外和计算机验证。
**四、研究结果**
**4.1 E. curvula品种组的倍性变异**
流式细胞术分析确认了12个品种的倍性水平：3个二倍体（PI208214、PI299920、Victoria），5个四倍体（Tanganyika INTA、Tanganyika USDA、Bahiense、OTA-S、Ermelo），3个六倍体（Don Luis、TUNS9355、Don Eduardo），1个七倍体（Don Pablo）。该品种组虽规模有限，但有效覆盖了该物种主要的种内倍性多样性。
**4.2 泛基因组构建**
通过10轮迭代映射和组装，泛基因组从Victoria参考基因组的603 Mb逐步扩展至过滤前的约899 Mb，最终经冗余和质体污染过滤后为895 Mb。各轮次新增序列量存在明显差异：第一个四倍体品种（Tanganyika USDA）和第一个六倍体品种（Don Luis）分别贡献约76 Mb和122 Mb，而同倍性后续品种贡献量递减（如Ermelo仅0.05 Mb）。无融合品种累计贡献252.1 Mb，而有性品种仅贡献44.3 Mb。最终过滤移除了4054条序列（4019条冗余和35条质体来源），表明组装策略在保留新序列的同时有效控制了冗余。
**4.3 基因注释**
MAKER三轮迭代注释共预测97,082个基因模型，较Victoria参考基因组的56,469个显著增加。重复序列占泛基因组装配的24%，低于单参考基因组，这与迭代组装主要添加独特序列而非重复区域的特征一致。BUSCO评估显示95.7%的完整度（66.5%单拷贝+29.2%重复拷贝），重复拷贝比例反映了多倍体基因组的代表性。
**4.4 基因存在/缺失变异检测**
PAV分析显示，基因含量随倍性增加而递增：二倍体平均77,365个基因，四倍体平均85,638.8个，六倍体平均93,923个，七倍体含93,981个。Welch's t检验表明二倍体与四倍体（p < 0.01）、二倍体与六倍体（p < 0.01）、四倍体与六倍体（p < 0.01）之间均存在显著差异。多倍体品种整体显著高于二倍体（p < 0.0001）。值得注意的是，同一倍性内部也存在明显变异，如无融合四倍体Tanganyika INTA（90,546个基因）远高于有性四倍体OTA-S（83,213个）。
**4.5 多倍化和无融合生殖相关基因的鉴定**
通过Venn图集合分析，582个基因被定义为多倍体相关基因（所有二倍体缺失、所有多倍体存在），406个基因被定义为无融合生殖相关基因（所有无融合品种存在、所有有性品种缺失），另鉴定出1个有性相关基因。两类基因集无重叠，表明多倍化和无融合生殖可能由两组不同的候选基因分别驱动。
**4.6 PAV的体外与计算机验证**
定性RT-PCR验证显示，PVA31样基因（与拟南芥PVA31同源，编码囊泡相关膜蛋白）仅在无融合品种中扩增出转录本，而有性品种中无扩增，且在所有样品中均成功扩增出内参基因UBICE，证实了PAV预测的准确性。计算机模拟PCR显示，EcAPO1和EcAPO2引物靶标定位于无融合相关基因集（分别注释为假定蛋白和CWC22样pre-mRNA剪接因子），而EcAPO3和EcAPO4引物靶标落入多倍体相关基因集（分别注释为A型细胞周期蛋白和F-box蛋白），与既往报道一致。
**4.7 多倍化和无融合生殖相关基因的GO富集分析**
多倍体相关基因显著富集于细胞周期调控相关GO条目，包括有丝分裂G2/M期转换、着丝粒和纺锤体相关功能以及DNA复制过程，核心贡献基因包括A型细胞周期蛋白（CycA2）、驱动蛋白（KIN-7）和复制蛋白A亚基（RPA2）；同时也富集了气孔复合体发育、异戊二烯转运、脱落酸转运等条目。无融合相关基因则显著富集于RNA加工和转录后调控条目，特别是催化性剪接体步骤1和步骤2复合体及U2型剪接体复合体，核心贡献基因为CWC22样pre-mRNA剪接因子；同时富集了茎维管组织模式形成和子叶形态发生等发育相关条目。
**4.8 TF/TR家族的鉴定**
TF/TR分析鉴定出两类基因集共享的调控家族（FAR1、B3、TRAF）和各类别特有的家族。多倍体相关基因特有的TF家族包括C2C2-Dof、C2H2、LOB/LBD、PLATZ和ZF-HD；无融合相关基因特有的TF家族包括AP2/ERF、MYB和NAC。AP2/ERF家族中包含BBM/PLT4这一已知参与胚胎发生的关键调控因子，其异位表达足以诱导水稻孤雌生殖。
**4.9 全基因组SNP分析**
经严格过滤后获得1,696,724个中性、基因间区、不连锁的双等位SNP。Neighbor-Net系统发育网络显示，高倍性兼性无融合品种（Don Luis、TUNS9355、Don Pablo）形成一个紧密相关的类群，Don Eduardo与它们连接于同一网络区域；Tanganyika INTA和Bahiense紧密成对，Ermelo与之相连；有性品种OTA-S（4x）和PI208214（2x）在网络上位置相近，Victoria（2x）和PI299920（2x）另成一对；Tanganyika USDA（4x，专性无融合）在网络中形成独立分支。SNP杂合度分析显示，高倍性兼性无融合品种的SNP-call杂合度最高（31.69%–33.49%），有性二倍体最低（6.57%–9.61%）。AF分布分析显示，二倍体品种的AF峰集中在0.5附近；四倍体品种显示约0.25、0.5和0.75的峰，但峰型分辨率和相对高度存在差异（如Tanganyika INTA和Bahiense呈典型类自四倍体型谱，Tanganyika USDA呈单一的0.5主峰类异四倍体型谱）；高倍性品种呈现更异质的多峰谱。
**五、讨论与结论**
研究人员通过构建涵盖多种倍性和生殖模式的线性泛基因组，系统揭示了E. curvula种内广泛的基因含量变异。该泛基因组为开放型结构，序列增长随同倍性品种的加入呈递减趋势，但六倍体品种Don Eduardo仍贡献了37.1 Mb新序列，表明序列贡献不仅受倍性影响，还与品种的遗传分化程度和加入顺序有关。多倍体品种平均基因数显著高于二倍体，且无融合品种较有性品种贡献了更多的泛基因组新序列，提示无融合生殖与基因含量的扩张存在关联。值得注意的是，除PVA31样基因外，本研究还发现PVA12样基因（此前报道仅在无融合品种中存在的囊泡相关蛋白基因）可能共同参与无融合生殖的发育调控。
功能富集结果揭示了两类候选基因的截然不同的功能特征：多倍体相关基因以细胞周期调控和DNA复制为核心，表明多倍化可能涉及细胞周期调控因子的剂量效应或功能获得，特别是A型细胞周期蛋白（CYCA2类）在拟南芥中已被证明直接控制内复制过程中的倍性水平；无融合生殖相关基因则以RNA加工和剪接体功能为主导，且CWC22样剪接因子在人类细胞中敲低后引起有丝分裂滑移，在突变小鼠中可导致雌性减数分裂驱动失衡，提示剪接调控可能是无融合生殖途径建立或维持的重要调控层。转录因子分析进一步支持了这一观点，特别是无融合相关基因中的AP2/ERF家族成员BBM/PLT4在稻中已被证明可在卵细胞中异位表达诱导孤雌生殖。
SNP分析结果与既往基于简单序列重复标记的品种关系研究基本一致（如Victoria与PI299920聚类、Tanganyika INTA与Bahiense共享育种历史），但也发现了新的信息，如PI208214与OTA-S的遗传相似性以及Tanganyika USDA在系统发育网络中的独立分支。AF谱分析提示四倍体品种间可能存在不同的基因组行为——Tanganyika INTA和Bahiense表现为类自多倍体模式（AF峰位于约0.25、0.5和0.75），而Tanganyika USDA表现为类异多倍体模式（AF峰主位于0.5），OTA-S和Ermelo则呈现更复杂的模式，可能涉及片段异源多倍体行为，与Cell前期的细胞遗传学证据一致。
综上所述，本研究表明E. curvula中多倍化与无融合生殖的频繁关联可能依赖于两组不同的候选基因：一组与多倍化相关（主要涉及细胞周期和DNA复制），另一组与无融合生殖相关（主要涉及转录后调控），二者的协同作用共同塑造了该物种的基因组结构和生殖策略。该研究为禾本科无融合生殖作物育种提供了候选基因资源，也为理解多倍化与无融合生殖共进化的分子机制提供了新的见解。
