基于偶联IgG-IgE阳性对照抗体的ELISA方法检测人血清中抗艾杜糖酶β IgE抗体的开发与验证

《Journal of Immunological Methods》：Development and validation of an ELISA-based assay for detecting anti-idursulfase beta IgE antibodies in human serum using a conjugated IgG-IgE positive control antibody

　　**摘要**艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶（IDS）基因的突变会导致亨特综合征（又称粘多糖贮积症II型，MPS II），这是一种罕见的遗传性疾病，会导致糖胺聚糖（GAGs）积累。尽管酶替代疗法（ERT）是通常的治疗方法，但它可能引起免疫反应，例如产生针对药物的特异性IgE抗体，从而导致超敏反应。在本研究中，我们开发了一种基于ELISA的检测方法，用于表征人血清中的抗艾杜糖醛酸硫酸酶beta IgE抗体，并验证了其分析可行性。使用传统方法产生针对IgE亚型的抗体存在复杂的挑战，这使得难以获得适用于IgE特异性检测的合适阳性对照抗体。为了克服这一困难，我们通过化学偶联抗IDS IgG抗体和人IgE抗体生成了IgG-IgE偶联抗体。利用这种偶联的IgG-IgE阳性对照抗体，我们开发了该检测方法，并按照免疫原性指南对其进行验证，评估了包括截止值、灵敏度、特异性、选择性、精密度、药物耐受性和稳定性在内的验证参数。结果表明，该检测方法在IgE亚型表征方面具有方法学适用性。**引言**亨特综合征，又称粘多糖贮积症II型（MPS II），是一种罕见的先天性疾病，由艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶（IDS）基因表达不足引起（Royce和Steinmann, 2003；Griffin和Gloster, 2017）。估计该病每10万人中约有1例受影响（Wraith等, 2008）。由于IDS基因与X染色体相关，且以隐性方式遗传，大多数受影响者为男性。IDS基因一个或多个部分的突变，如缺失、替换或重排，导致IDS酶缺乏（Giugliani等, 2010；Whiteman和Kimura, 2017；D'Avanzo等, 2020）。因此，糖胺聚糖（GAGs）不能正常降解，并在细胞、组织和器官的溶酶体中积累，导致疾病。在各种类型的GAGs中，亨特综合征的特征是硫酸皮肤素（DS）和硫酸乙酰肝素（HS）的积累（Clarke, 2008；Whiteman和Kimura, 2017；D'Avanzo等, 2020；Penon-Portmann等, 2023）。IDS基因突变的严重程度影响酶缺乏和GAGs积累的水平，导致受影响个体出现不同的症状和疾病进展。典型症状包括肝脾肿大、关节畸形、生长迟缓、听力损失和认知衰退（D'Avanzo等, 2020；Penon-Portmann等, 2023）。亨特综合征通常采用酶替代疗法（ERT）治疗，即给予重组IDS酶以补偿缺乏的酶并防止GAGs等代谢产物积累。该治疗已被证明能有效阻止疾病进展（Giugliani等, 2010；Penon-Portmann等, 2023）。在韩国，艾杜糖醛酸硫酸酶（Elaprase?，Takeda）和艾杜糖醛酸硫酸酶beta（Hunterase?，GC Biopharma）已获批用于亨特综合征的ERT。这两种治疗性蛋白均由相同的525个氨基酸重组人艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶组成，通过每周一次静脉输注给药，剂量为每公斤体重0.5 mg（Kim等, 2017；Ngu等, 2017；Chan等, 2023）。然而，ERT等治疗性蛋白的给药可能引起不良免疫反应。免疫原性是指治疗性蛋白或其相关蛋白引发免疫反应或引起临床相关免疫不良反应的能力（美国食品药品监督管理局, 2014；Concolino等, 2018；de la Fuente等, 2021）。影响免疫原性的因素包括产品特异性因素，如蛋白结构、制剂和杂质，以及患者特异性特征，如年龄、性别、遗传背景、疾病状态、给药途径和持续时间、治疗方案等（美国食品药品监督管理局, 2014；欧洲药品管理局, 2017）。评估免疫原性风险至关重要，因为针对治疗性蛋白的免疫反应的存在及其临床影响可能会显著影响患者安全性和有效性（Shankar等, 2014；Pineda等, 2016；Song等, 2016）。通常，为此目的测量体液免疫应答产生的抗体（Song等, 2016）。一种分步方法，包括筛选、确证和滴度测定，用于定性和半定量评估患者体内产生的抗体，即抗药抗体（ADA）检测，用于识别针对治疗性蛋白的抗体（美国食品药品监督管理局, 2019）。中和抗体（NAb）研究也被用来确定抗体是否干扰药物的治疗作用。为了评估潜在临床风险，建议对产生的抗体进行额外表征，包括与内源性蛋白的交叉反应性、亚型评估和表位特异性（Mire-Sluis等, 2004；美国食品药品监督管理局, 2019；Civoli等, 2020；Myler等, 2022）。特别是，对于有过敏性休克风险的患者，检测和监测药物特异性IgE抗体具有重要意义（Kim等, 2013；Gorovits, 2020）。用于检测免疫反应产生的抗体的ADA检测方法通常采用桥式检测格式，其优点是可以测量针对药物产生的所有亚型的抗体。然而，该方法无法区分各个亚型。这一局限性对于IgE抗体尤为重要，因为药物特异性IgE抗体与速发型超敏反应和过敏性反应相关，凸显了能够特异检测和表征该亚型的分析方法的重要性。在人类五种免疫球蛋白亚型（IgA、IgD、IgG、IgE和IgM）中，IgG占大多数，而IgE含量最低。此外，抗药IgE抗体可能仅占总体ADA应答的一小部分，并可能在传统ADA检测中被占主导地位的IgG应答所掩盖。因此，IgE的检测需要一种灵敏度显著更高的独立分析方法（Gorovits, 2020；美国食品药品监督管理局, 2019）。测量特异性ADA亚型需要针对每个亚型的特定检测格式和阳性对照抗体（Gunn等, 2016；Jiang等, 2020）。然而，已知通过免疫化产生能够区分亚型的多克隆抗体具有挑战性，尤其是对IgE亚型而言，因为动物中仅产生微量IgE抗体，且这些抗体在纯化过程中大多丢失（Leenaars和Hendriksen, 2005；Boridy, 2019；Smith等, 2023）。在本研究中，为了克服产生阳性对照抗体的挑战，我们通过化学偶联抗IDS IgG抗体和人IgE抗体组装了IgG-IgE偶联抗体。利用这种偶联的IgG-IgE作为阳性对照抗体，我们开发并分析验证了一种基于ELISA的方法，用于检测人血清中的抗艾杜糖醛酸硫酸酶beta IgE抗体。**章节摘要****材料**IgG-IgE阳性对照抗体通过蛋白质-蛋白质偶联试剂盒（Vector Laboratories, S-9010-1），使用人艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶IgG抗体（R&D Systems, AF2449）和人IgE抗体（EMD Millipore, 401152）进行偶联。IgG-IgE偶联阳性对照抗体的浓度使用纳升微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific, NanoDrop 2000c）测定，在280 nm处测量吸光度。微孔板使用温控...**抗艾杜糖醛酸硫酸酶beta IgE检测方法的开发**评估了两种检测格式，艾杜糖醛酸硫酸酶beta包被格式产生的信号强于抗人IgE包被格式（图2）。偶联的IgG-IgE抗体产生了一致的ELISA反应，并作为合适的阳性对照。两种使用该抗体的生物分析方法均适用于测量血清中的IgE亚型抗艾杜糖醛酸硫酸酶beta抗体。然而，两种方法之间的灵敏度存在差异。因此，我们选择了艾杜糖醛酸...**结论**在本研究中，我们开发并验证了一种基于ELISA的方法，用于检测人血清中的抗艾杜糖醛酸硫酸酶beta IgE抗体。我们没有使用传统的抗体生产方法来生成阳性对照抗体，而是通过化学偶联抗IDS IgG抗体和人IgE抗体产生了一种IgG-IgE嵌合抗体，用作IgE亚型检测的阳性对照。该检测方法随后按照...进行了开发和验证**CRediT作者贡献声明****Ha Wook Chung：** 写作 – 原稿。**Shi Nae Kwon：** 监督。**Jeungwoon Hong：** 调查研究。**Jeong Hun Kim：** 写作 – 审阅与编辑，监督，项目管理，概念化。**伦理声明**本研究无需伦理批准或知情同意。**致谢**Ha Wook Chung受雇于GC BioPharma。GC BioPharma员工的参与不影响本研究的科学完整性。其他作者报告无利益冲突。本研究由**首尔国立大学医院**研究基金（18-2023-0010，资助J.H.K.）支持。Ha Wook Chung | Shi Nae Kwon | Jeungwoon Hong | Jeong Hun Kim