基于多克隆抗体的虹鳟白细胞介素-4/13B1夹心ELISpot检测方法的建立

《Fisheries Science》：Development of a polyclonal antibody-based sandwich ELISpot assay for interleukin-4/13B1 in rainbow trout Oncorhynchus mykiss

　　

在哺乳动物中，白细胞介素-4（IL-4）和IL-13是重要的Th2型细胞因子，可增强B细胞的抗体产生和Th2细胞的增殖。鲑科鱼类经历了四轮全基因组复制事件，拥有这两种细胞因子的三个同源基因，分别命名为IL-4/13A、IL-4/13B₁和IL-4/13B₂。本研究旨在开发一种夹心ELISpot检测方法，用于评估虹鳟（Oncorhynchus mykiss）浸泡免疫后的Th2免疫应答。研究人员首先分析了灭活耶尔森氏菌（Yersinia ruckeri）浸泡免疫后三个同源基因的基因表达。IL-4/13B₁在免疫后第7天鳃中的转录水平显著升高。随后，研究人员获得了针对虹鳟IL-4/13B₁的兔多克隆抗体（检测抗体）和豚鼠多克隆抗体（捕获抗体），并将其用于夹心ELISpot检测。ELISpot检测清晰检测到IL-4/13B₁的产生，并显示与未免疫组相比，浸泡免疫后第7天鳃中产生IL-4/13B₁的细胞数量显著增加。这一新工具使研究人员能够评估虹鳟中由IL-4/13B₁介导的Th2应答，并揭示了浸泡免疫后产生IL-4/13B₁的细胞主要在鳃中增加。

鱼类养殖中常见的疫苗接种方式包括注射、口服和浸泡。注射免疫虽能诱导强免疫，但操作成本高且造成应激；口服免疫因肠道耐受和抗原降解而效果有限；浸泡免疫可大规模低成本接种，但仅对少数细菌性疾病有效，因此理解其机制至关重要。细胞因子是免疫调节的重要分子，检测细胞因子能反映个体免疫状态。夹心ELISA在哺乳动物和部分鱼类中已用于细胞因子检测，而ELISpot技术虽在鱼类中用于抗体分泌细胞检测，但尚未见用于细胞因子检测的报道。虹鳟（Oncorhynchus mykiss）具有IL-4/13A、IL-4/13B₁和IL-4/13B₂三个哺乳动物IL-4/IL-13同源基因，其中IL-4/13B₁在免疫应答中表达变化显著，被认为是潜在的Th2免疫标志物。因此，研究人员旨在开发针对虹鳟IL-4/13B₁的多克隆抗体夹心ELISpot检测方法，以评估浸泡免疫后的Th2免疫应答。

研究人员利用灭活耶尔森氏菌（Yersinia ruckeri）菌苗对虹鳟进行浸泡免疫，首先通过实时PCR分析三个同源基因在鳃和脾脏中的转录变化，发现IL-4/13B₁在免疫后第7天鳃中显著上调。随后制备了兔和豚鼠的抗IL-4/13B₁多克隆抗体，通过免疫细胞化学和western blotting确认其特异性，建立夹心ELISA并优化ELISpot条件。ELISpot结果显示，浸泡免疫后第7天，鳃和脾脏中产生IL-4/13B₁的细胞数量均显著增加，且鳃中的斑点数量远高于脾脏。该工具的建立为虹鳟Th2免疫反应的研究及疫苗优化提供了新手段。

研究采用的主要技术方法包括：使用来自西班牙Cifuentes鱼场的虹鳟（约30 g），以灭活Y. ruckeri（血清型01）菌苗进行浸泡免疫（1×10⁷ CFU/mL，30 min），并设PBS模拟免疫组。通过实时PCR检测IL-4/13A、IL-4/13B₁、IL-4/13B₂的转录水平，以EF-1α为内参。利用兔和豚鼠分别免疫合成多肽制备多克隆抗体，经E. coli吸附减少非特异性反应；使用RTG-2细胞转染表达各同源基因验证抗体特异性。夹心ELISA以豚鼠抗体为捕获抗体、兔抗体为检测抗体，检测重组IL-4/13B₁。ELISpot采用30%/51% Percoll密度梯度离心分离鳃和脾脏白细胞，以5×10³细胞/孔孵育，通过斑点计数统计产生IL-4/13B₁的细胞数量。

**基因表达分析**：通过实时PCR检测浸泡免疫后2天和7天鳃和脾脏中三个IL-4/13同源基因的转录水平。结果显示，鳃中IL-4/13B₁在免疫后第7天显著上调，IL-4/13B₂呈上升趋势但无显著差异，IL-4/13A无显著变化；脾脏中各基因均无显著变化。

**抗体的反应性和交叉反应性**：通过免疫细胞化学检测兔和豚鼠抗IL-4/13B₁多克隆抗体对转染IL-4/13A、IL-4/13B₁或IL-4/13B₂表达质粒的RTG-2细胞的反应性。两种抗体仅与表达IL-4/13B₁的细胞产生荧光信号，不与IL-4/13A或IL-4/13B₂反应，表明抗体具有高度特异性。

**夹心系统的建立**：Western blotting确认兔和豚鼠抗血清均能识别重组IL-4/13B₁而不识别IL-4/13A。夹心ELISA可检测重组IL-4/13B₁，在0.39至200 ng/mL浓度范围内吸光度呈剂量依赖性下降，且各稀释度间差异显著，表明该系统可用于定量检测。

**IL-4/13B₁的ELISpot检测**：利用建立的夹心ELISpot检测浸泡免疫后7天虹鳟鳃和脾脏白细胞中IL-4/13B₁产生细胞。结果显示，免疫鱼鳃中斑点数量显著高于对照组，脾脏中也有少量但统计学上显著增加的斑点，且鳃中的斑点数量远高于脾脏。

在讨论中，研究人员指出IL-4/13B₁在浸泡免疫后鳃中的显著上调表明其可能是虹鳟Th2免疫应答的功能性标志物。多克隆抗体组合的ELISpot检测与基因表达结果一致，验证了该方法的可靠性。ELISpot结果揭示鳃是浸泡免疫后Th2细胞诱导的主要部位，这可能与鳃上皮中表达MHC II类分子的GAS细胞摄取菌苗并呈递抗原有关；脾脏中少量增加提示脾脏也参与系统性Th2免疫的诱导。该研究结论为：研究人员成功开发了基于多克隆抗体的夹心ELISpot检测方法，用于检测虹鳟中产生IL-4/13B₁的细胞；浸泡免疫可诱导鳃和脾脏中IL-4/13B₁产生细胞显著增加，尤其是在鳃中。该ELISpot方法可作为评估虹鳟Th2免疫反应的有力工具，并有助于鱼类疫苗的优化。