《Journal of Food Measurement and Characterization》：Evaluation of a fermented citrus bioconversion product: metabolic and hepatic effects in high-fat diet-fed mice
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尽管人们对发酵柑橘来源的功能性成分兴趣日益增加，但其在饮食诱导肥胖中的代谢效应以及发酵制备物的化学特征仍未得到充分表征。本研究对一种发酵柑橘生物转化产物（fermented citrus bioconversion product, FCBP）进行了表征，并评
尽管人们对发酵柑橘来源的功能性成分兴趣日益增加，但其在饮食诱导肥胖中的代谢效应以及发酵制备物的化学特征仍未得到充分表征。本研究对一种发酵柑橘生物转化产物（fermented citrus bioconversion product, FCBP）进行了表征，并评估了其在高脂饮食（high-fat diet, HFD）诱导的肥胖小鼠模型中的代谢效应。FCBP通过枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对富含柑橘黄酮的底物进行微生物发酵生产，并通过HPLC指纹图谱进行表征。饲喂含45%千卡脂肪的HFD小鼠每日口服FCBP（10或20 mg/kg），持续8周，并以橙皮苷（hesperidin）作为对比参照化合物。与HFD组相比，20 mg/kg FCBP显著减弱了体重增加并降低了血浆甘油三酯水平。组织学分析进一步表明，FCBP显著减少了HFD诱导的肝脏脂肪变性。FCBP还与肝脏葡萄糖和脂质代谢相关基因的表达改变有关，包括SREBP1c、ACC1、PPARγ、GLUT4（Slc2a4）、PGC-1α和PPARα。值得注意的是，SREBP1c mRNA表达增加伴随ACC1表达下降和肝脏脂肪变性减轻，表明转录反应不支持简单统一的肝脏脂肪生成抑制模型。FCBP处理还减少了HFD条件下主动脉VCAM-1和ICAM-1阳性区域。总体而言，这些发现证明了FCBP在HFD喂养小鼠中具有选择性的代谢和组织水平效应。然而，由于未包含匹配的非发酵柑橘制备物，观察到的效应不能特异性地归因于发酵过程，有必要进行进一步的全面化学和机制表征。
全球肥胖及其相关代谢疾病如2型糖尿病（T2DM）、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心血管疾病的患病率持续上升，已成为重大公共卫生挑战。高脂饮食（high-fat diet, HFD）是促进肥胖发展的关键因素之一，其可导致脂肪组织扩张和肝脏等代谢器官的异位脂质沉积。因此，能够改善代谢调节且不良反应少于传统药物疗法的功能食品和膳食生物活性化合物受到广泛关注。柑橘黄酮尤其是橙皮苷（hesperidin）具有抗氧化、抗炎和脂质调节特性，但其水溶性低、肠道吸收有限，限制了实际应用。柑橘皮富含果胶、纤维素、蛋白质、多酚、黄酮等多种成分，是功能食品原料的潜在来源。微生物发酵作为一种食品加工策略，可改变植物原料的化学组成并产生多种代谢产物。已有研究提示发酵柑橘来源制品可能具有有益代谢效应，但对其在受控实验条件下的代谢效应及化学特性仍缺乏充分表征。为此，研究人员制备并表征了一种发酵柑橘生物转化产物（fermented citrus bioconversion product, FCBP），在HFD诱导肥胖小鼠模型中评估其代谢效应，重点观察体重调控、血浆脂质、肝脏脂肪变性及糖脂代谢相关基因表达。
研究人员采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵富含黄酮的柑橘底物获得FCBP，并通过高效液相色谱（HPLC）多波长指纹图谱进行化学表征。动物实验使用8周龄雄性C57BL/6J小鼠（来自Raon Bio，龙仁，韩国），适应1周后随机分为6组：对照饮食组（Ctrl）、HFD组、HFD+FCBP 10 mg/kg/天组、HFD+FCBP 20 mg/kg/天组、HFD+橙皮苷10 mg/kg/天组和HFD+橙皮苷20 mg/kg/天组，每组12只，干预持续8周。结果显示，FCBP 20 mg/kg显著降低累积体重增加约31.3%，且不伴食物摄入的显著变化；FCBP 20 mg/kg显著降低血浆甘油三酯（TG）水平；组织学分析显示FCBP显著减少HFD诱导的肝脏脂肪变性面积。FCBP还改变肝脏SREBP1c、ACC1、PPARγ、GLUT4（Slc2a4）、PGC-1α和PPARα等代谢相关基因的mRNA表达，并减少主动脉VCAM-1和ICAM-1免疫阳性面积。这些发现为FCBP作为复杂发酵制剂的代谢和组织水平效应提供了初步体内证据，但尚不能归因于发酵过程或单一成分。
关键技术方法：FCBP由Vitech Co., Ltd.（完州，韩国）提供，最初来源于Hughes Biotechnology Co., Ltd.（台北，台湾），通过Bacillus subtilis BCRC 80517发酵柑橘黄酮富集底物制备，离心取上清冻干。采用HPLC多波长（220、250、288、310、370 nm）指纹图谱鉴定主要特征产物——橙皮素3′-O-磷酸（HES-3′P）和橙皮素7-O-磷酸（HES-7P）。动物模型使用8周龄雄性C57BL/6J小鼠，随机分6组（n=12），口服灌胃8周。检测方法包括血浆脂质谱分析、Griess法测亚硝酸盐、肝组织H&E染色结合ImageJ定量脂肪变性、qRT-PCR检测肝脏基因表达、主动脉免疫荧光定量VCAM-1和ICAM-1阳性面积。
主要研究结果如下：
**FCBP的化学表征**：通过多波长HPLC指纹图谱，鉴定出HES-3′P和HES-7P为FCBP的主要特征性橙皮素衍生生物转化产物，确认了该制剂含微生物生物转化相关成分。
**对HFD小鼠体重、食物摄入、食物效率比和肝重的影响**：与HFD组相比，FCBP 20 mg/kg显著降低累积体重增加31.3%，食物摄入无显著差异；食物效率比（FER）数值降低但未达统计学显著。FCBP处理组绝对肝重显著低于HFD组，相对肝重亦降低，但由于HFD组体重明显增加，相对肝重降低在一定程度上反映体重分母增大。
**对肝脏脂肪变性的影响**：H&E染色显示HFD组肝脏脂质蓄积和脂肪变性明显，定量分析证实脂肪变性面积显著增加。FCBP 10和20 mg/kg均显著减少脂肪变性面积，20 mg/kg效果更明显；橙皮苷两个剂量也均显著减少。
**对血浆脂质谱的影响**：HFD显著升高HDL-C、LDL-C和总胆固醇（TC），TG在Ctrl与HFD间无显著差异。FCBP 20 mg/kg显著降低血浆TG；LDL-C和TC数值降低但无统计学意义，HDL-C及HDL-C/LDL-C比值无显著改变。
**对血浆亚硝酸盐水平的影响**：Griess法检测显示FCBP和橙皮苷均未显著改变血浆亚硝酸盐浓度。
**对肝脏糖脂代谢基因表达的影响**：qRT-PCR显示，HFD组ACC1、PPARγ和GLUT4（Slc2a4）表达显著升高，FCBP处理后这些基因表达显著降低。FCBP 20 mg/kg显著升高PGC-1α和PPARα表达。SREBP1c mRNA在FCBP处理后增加，但伴随ACC1下降和肝脂肪变性减少，说明转录反应不支持简单统一的脂质合成抑制模型。
**对主动脉VCAM-1和ICAM-1免疫反应性的影响**：HFD显著增加主动脉VCAM-1和ICAM-1阳性面积，FCBP两个剂量均显著降低这两个黏附分子的阳性面积，橙皮苷亦显著降低。
讨论部分总结指出，FCBP减轻体重增加并非因摄食显著减少，但未测定能量消耗和体成分，机制不明确。血浆脂质效应以TG降低为主，未显示广谱调脂作用。肝脏重量变化需谨慎解读，组织学证据更直接支持FCBP改善肝脂蓄积。SREBP1c mRNA增加与ACC1降低之间的不一致提示功能层面的复杂性，不能以mRNA水平简单推断脂肪合成活性。PPARα和PGC-1α升高提示可能涉及脂肪酸氧化，但需蛋白和功能测定验证。GLUT4在肝脏中的意义有限，需进一步研究。主动脉黏附分子减少提示潜在血管保护作用，但需炎症因子和内皮功能检测确认。化学表征为靶向性，FCBP中未表征成分的作用无法排除。主要局限性包括缺乏匹配非发酵对照、未做全面代谢组学、未测脂肪组织学、肝TG含量、能量消耗、体成分以及仅使用雄性小鼠。未来需要加入匹配的发酵与非发酵对照，进行综合化学剖析和蛋白质功能水平验证。
研究结论可翻译为：总之，FCBP补充减弱了HFD喂养小鼠的体重增加，降低了血浆甘油三酯水平，并改善了肝脏脂肪变性。FCBP处理还改变了参与葡萄糖和脂质代谢的肝脏基因表达，并减少了主动脉VCAM-1和ICAM-1阳性面积。HPLC指纹图谱进一步表征了FCBP，并鉴定出橙皮素3′-O-磷酸（HES-3′P）和橙皮素7-O-磷酸（HES-7P）为主要特征性橙皮素衍生生物转化产物。然而，不同的转录反应，特别是SREBP1c mRNA增加而ACC1 mRNA和肝脏脂肪变性减少，不支持简单统一的肝脏脂肪生成抑制模型。此外，由于化学表征是靶向而非全面的，且未包括匹配的非发酵柑橘制备物，观察到的效应不能归因于单一成分或特异性地归因于发酵过程。因此，本研究发现提供了FCBP作为完整发酵制剂的靶向化学表征和选择性代谢及组织水平效应的体内证据。需要纳入匹配的发酵和非发酵对照、全面的代谢组学分析以及蛋白质和功能水平分析的进一步研究，以建立组成-功能关系并阐明微生物生物转化的具体贡献。
