铜死亡在肿瘤中的免疫原性：从损伤相关分子模式释放到免疫检查点抑制剂协同治疗

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Cell death: immunogenic potential of cuproptosis in cancer

　　

《细胞》杂志近期发表的数据表明，一种依赖Cu²⁺的调节性细胞死亡（regulated cell death, RCD）形式——通常称为铜死亡（cuproptosis）——具有免疫原性，可导致恶性细胞释放损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs），并启动适应性抗肿瘤免疫应答，该应答不仅放大铜死亡的诱导效应，还可被免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）增效。特定RCD模式能否引发抗原特异性、靶向肿瘤的免疫应答（伴随效应期和免疫记忆，从而符合真正意义上的免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD））取决于多个变量。具体而言，濒死肿瘤细胞要激发适应性抗肿瘤免疫，必须：（1）表达不受中枢耐受保护的相关抗原；（2）在死亡过程中以时空定义明确的方式释放多种DAMPs；（3）在免疫学上许可的肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中发生RCD。重要的是，RCD相关DAMP释放深受细胞死亡之前、驱动并伴随细胞死亡的生化事件影响。因此，坏死性凋亡（necroptosis）由混合谱系激酶结构域样假激酶（mixed lineage kinase domain like pseudokinase, MLKL）介导的质膜透化执行，是一种高度免疫原性的RCD形式；而凋亡（apoptosis）由不可逆且广泛的线粒体外膜透化（mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP）执行，并伴随线粒体后caspase激活，通常以免疫沉默或明显耐受原的方式发生。在此背景下，依赖Fe²⁺的细胞死亡形式——铁死亡（ferroptosis）的免疫原性潜力仍存争议，且可能高度依赖上下文。相反，Lei及其同事最近提供了令人信服的证据，表明药理学诱导铜死亡具有明显的免疫原性，并能启动靶向肿瘤的免疫应答，该应答通过前馈放大环进一步增强铜死亡反应。这些数据不仅将铜死亡列入公认的ICD模式清单，还指出肿瘤细胞中铜死亡的激活是将免疫学“冷”肿瘤转化为对ICIs有反应的免疫学“热”病灶的理想治疗目标。Lei及其同事旨在研究抗肿瘤免疫是否影响发育中肿瘤对药理学铜死亡诱导的敏感性。Cu²⁺离子载体对在免疫活性宿主中发育的多种小鼠肿瘤的抗肿瘤活性显著高于在免疫缺陷宿主中的活性。这种差异化疗效可被药理学Cu²⁺螯合剂有效阻断，并与TME中Cu²⁺积累以及铜死亡相关蛋白脂酰化（lipoylation）和二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶（dihydrolipoamide S-acetyltransferase, DLAT）聚集相关。接下来，研究人员评估了体外暴露于Cu²⁺离子载体的小鼠结直肠癌（colorectal carcinoma, CRC）MC38细胞ICD相关DAMP释放，证明了Cu²⁺离子载体能促进ATP分泌、钙网蛋白（calreticulin, CALR）暴露、高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1, HMGB1）释放以及I型干扰素（interferon, IFN）信号传导。相应地，体外发生铜死亡的MC38细胞能有效接种肿瘤初治同基因小鼠，使其抵抗活MC38细胞的再次攻击。此外，体内对Cu²⁺离子载体有反应的已建立MC38病灶的TME和肿瘤引流淋巴结表现出树突状细胞（dendritic cell, DC）激活、CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）启动和效应功能以及肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage, TAM）向抗肿瘤M1样表型复极化的标志。相应地，治疗疗效在机制上依赖于DC和CD8⁺ CTL的存在以及干扰素γ（interferon gamma, IFNG，最广为人知的名称为IFNγ）的活性，并且可通过增强M1样TAM极化的单克隆抗体增强。有趣的是，Cu²⁺离子载体体外杀伤人Hs578T乳腺癌细胞和人OE33食管癌细胞的能力可被活化T细胞上清液增强，这种协同反应与细胞内Cu²⁺水平和DLAT聚集相关，并可被Cu²⁺螯合剂和IFNγ中和抗体阻断，但不能被凋亡、坏死性凋亡和铁死亡药理学抑制剂阻断。使用重组IFNγ也可获得类似结果。此外，重组IFNγ与Cu²⁺离子载体在控制免疫缺陷小鼠中OE33异种移植瘤方面具有协同作用。在机制上，Cu²⁺离子载体（单独或联合重组IFNγ）的体内肿瘤控制及伴随的TME中Cu²⁺积累依赖于恶性细胞表达IFNγ信号通路的多种组分，特别是干扰素调节因子1（interferon regulatory factor 1, IRF1）和信号转导与转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1, STAT1），最终导致促铜死亡酶铁氧还蛋白1（ferredoxin 1, FDX1）上调。在免疫活性宿主中建立并对Cu²⁺离子载体联合重组IFNγ有反应的MC38病灶TME中，FDX1表达也可通过清除CD8⁺ CTL和阻断IFNγ来阻止。Fdx1缺失损害了Cu²⁺离子载体对MC38 CRC的体内控制以及Cu²⁺离子载体联合重组IFNγ对培养MC38细胞的杀伤。重要的是，重组IFNγ所有铜死亡相关体外后果均被证明在机制上依赖于IRF1与FDX1启动子的结合。最后，Cu²⁺离子载体被证明能在MC38 CRC和小鼠EMT6三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer, TNBC）病灶中增加共抑制配体CD274（最广为人知的名称为PD-L1）的表达，从而与小鼠PD-L1阻断剂产生治疗协同。后者有效增强了TME中CD8⁺和CD4⁺ T细胞激活，并与FDX1表达、Cu²⁺积累、蛋白脂酰化和DLAT聚集相关。在包括含转移成分的模型在内的多种免疫活性肿瘤模型中也获得了类似发现。最后，来自接受ICIs治疗的多个癌症患者队列的TME样本和测序数据记录了应答者中FDX1水平高于无应答者，以及FDX1水平与总生存期之间的正相关性。总之，Lei及其合作者巧妙地证明，铜死亡是一种真正意义上的ICD变体，它启动了一个基于IFNγ、依赖FDX1的放大回路，具有显著的免疫治疗效应。除了将铜死亡加入明显免疫原性RCD模式清单外，这些发现还表明，诱导铜死亡可能构成一种有效方法，可强力炎症化免疫学“冷”恶性肿瘤的TME，从而使其对ICIs免疫治疗敏感。值得注意的是，Lei及其同事未在接收铜死亡诱导剂（单独或联合ICIs）的小鼠中检测到重大毒性，但他们报告的大多数体内实验持续时间相对较短。因此，由于铜死亡通过线粒体蛋白（特别是三羧酸循环组分）的脂酰化展开，长期全身性给予铜死亡诱导剂仍可能对具有高线粒体代谢的组织（如脑、肌肉和心脏）产生不利影响。鉴于接受ICIs患者中报告的罕见心肌炎病例的严重性（在小鼠中无法复制），这对于涉及铜死亡诱导剂和ICI的联合（免疫）治疗方案开发可能尤其令人担忧，理想情况下需要靶向或局部给药策略和/或扩大监测计划。前馈放大抗肿瘤免疫的铜死亡机制：暴露于Cu²⁺离子载体的恶性细胞发生免疫原性细胞死亡（ICD），伴随大量促炎细胞因子和免疫刺激分子（统称为损伤相关分子模式（DAMPs））的释放。发生ICD的癌细胞在促进树突状细胞（DC）依赖的CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞（CTL）激活方面特别有效，最终以干扰素γ（IFNG，最广为人知的名称为IFNγ）分泌作为抗肿瘤免疫的一部分。重要的是，IFNγ信号传导似乎也促进铜死亡，从而与Cu²⁺离子载体协同作用，至少部分通过促进促铜死亡酶铁氧还蛋白1（FDX1）的上调，从而建立具有治疗价值的前馈放大回路。与此同时，IFNγ还促进CD274（最广为人知的名称为PD-L1）上调，为开发包含铜死亡诱导剂和免疫检查点抑制剂（ICIs）的联合方案提供了额外理由。尽管存在这些和其他潜在局限性，铜死亡仍是一种具有前景但迄今未经临床探索的（免疫）治疗潜力的RCD模式。临床可行的铜死亡诱导剂亟待开发，以便在肿瘤患者中正式评估该策略的安全性和有效性。

铜死亡免疫原性的研究突破：从机制解析到肿瘤免疫治疗新策略

一、研究背景与科学问题

调节性细胞死亡（regulated cell death, RCD）是机体维持稳态和应对应激的重要机制，不同RCD模式的免疫学后果差异显著。免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD）是一类能够激发抗原特异性抗肿瘤免疫应答的细胞死亡模式，其特征是死亡细胞在时空上协调释放损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs），并具备诱发效应期和免疫记忆的能力。既往研究已明确，坏死性凋亡（necroptosis）因混合谱系激酶结构域样假激酶（MLKL）介导的质膜透化而具有高度免疫原性，而凋亡通常表现为免疫沉默或耐受原性。铁死亡（ferroptosis）的免疫原性尚存争议且可能依赖具体上下文。2023年前后，一种依赖Cu²⁺的新型RCD——铜死亡（cuproptosis）被报道，其核心机制是铜离子与三羧酸循环中脂酰化蛋白直接结合，导致蛋白毒性应激和细胞死亡。然而，铜死亡是否具有免疫原性、能否激发抗肿瘤免疫应答以及能否与免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）联合应用，此前尚无系统研究。Lei等人针对这一关键科学问题展开研究，旨在明确铜死亡的免疫学特征及其在肿瘤免疫治疗中的转化潜力。该研究发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》。

二、研究内容与核心发现概述

研究人员首先利用免疫活性与免疫缺陷小鼠模型，比较了Cu²⁺离子载体对多种移植瘤的抗肿瘤疗效，发现免疫活性宿主中疗效显著更优，且与肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中铜积累及脂酰化蛋白聚集相关，提示适应性免疫参与铜死亡诱导的抗肿瘤效应。随后，通过体外DAMP释放检测和疫苗接种实验证实铜死亡具有典型ICD特征。在体内模型中，研究人员观察到铜死亡诱导的树突状细胞（DC）激活、CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞（CTL）启动及肿瘤相关巨噬细胞（TAM）M1样复极化。进一步机制研究表明，T细胞来源的干扰素γ（IFNγ）通过IRF1转录上调促铜死亡酶铁氧还蛋白1（FDX1），形成前馈放大回路。最后，研究人员发现铜死亡诱导剂上调PD-L1表达，与PD-L1阻断剂产生协同治疗效应，并在患者数据中验证了FDX1水平与ICIs疗效及生存期的相关性。

三、主要关键技术方法

该研究综合运用了多类技术手段。在体内模型方面，使用了免疫活性（野生型）和免疫缺陷（裸鼠或SCID等）小鼠移植瘤模型，以及多种同基因肿瘤模型如MC38结直肠癌、EMT6三阴性乳腺癌，部分模型含转移灶。体外实验采用人Hs578T乳腺癌、人OE33食管癌等细胞系。主要方法包括：Cu²⁺离子载体（如elesclomol）和Cu²⁺螯合剂（如TTM）的药理学干预；CRISPR/Cas9基因敲除技术（Fdx1）；流式细胞术检测细胞表面CALR暴露、CD8⁺/CD4⁺ T细胞激活、TAM极化；ELISA或比色法检测ATP、HMGB1释放；RNA测序或转录组分析；染色质免疫沉淀（ChIP）验证IRF1与FDX1启动子结合；体内细胞耗竭实验（抗CD8、抗IFNγ等）；异种移植瘤模型；人肿瘤队列（接受ICIs治疗的多个癌症患者）的TME样本和测序数据生存分析。

四、研究结果分述

（一）Cu²⁺离子载体在免疫活性宿主中表现出更强的抗肿瘤活性

Lei等人发现，Cu²⁺离子载体对在免疫活性小鼠中生长的多种肿瘤（包括MC38 CRC、EMT6 TNBC等）的抑制作用显著强于免疫缺陷小鼠。这种差异可被Cu²⁺螯合剂消除，并与TME中铜积累、蛋白脂酰化及DLAT聚集相关。该结果首次证明抗肿瘤免疫是铜死亡疗法疗效的重要组成部分。

（二）铜死亡触发ICD相关DAMP释放并具有疫苗接种效应

体外实验中，暴露于Cu²⁺离子载体的MC38细胞释放ATP、CALR暴露、HMGB1释放并激活I型干扰素信号。将发生铜死亡的MC38细胞接种至未治疗的同基因小鼠后，小鼠能抵抗活MC38细胞的再次攻击，证明铜死亡能诱导保护性抗肿瘤免疫记忆。

（三）铜死亡激活DC、CTL并重编程TAM

体内对Cu²⁺离子载体有反应的MC38病灶中，肿瘤引流淋巴结和TME内DC激活标志物上调，CD8⁺ CTL启动和效应功能增强，TAM向M1样抗肿瘤表型复极化。治疗依赖性消耗DC或CD8⁺ T细胞或用抗体阻断IFNγ会削弱疗效，而增强M1样TAM极化的抗体则提高疗效。

（四）IFNγ与Cu²⁺离子载体协同杀伤肿瘤细胞

活化T细胞上清液或重组IFNγ可增强Cu²⁺离子载体对Hs578T和OE33细胞的杀伤作用，该协同效应与细胞内铜水平和DLAT聚集增加相关，且可被Cu²⁺螯合剂或IFNγ中和抗体阻断，但不受凋亡、坏死性凋亡和铁死亡抑制剂影响。在免疫缺陷小鼠中，重组IFNγ与Cu²⁺离子载体联合控制OE33异种移植瘤的疗效优于单药。

（五）IFNγ通过IRF1上调FDX1建立前馈放大回路

机制上，IFNγ信号通路（STAT1和IRF1）激活导致FDX1表达上调。体内清除CD8⁺ T细胞或阻断IFNγ能消除Cu²⁺离子载体联合IFNγ诱导的FDX1表达。Fdx1缺失则削弱Cu²⁺离子载体对MC38肿瘤的体内控制以及联合治疗对培养细胞的杀伤。ChIP实验证实IRF1直接结合FDX1启动子。这一回路说明T细胞分泌的IFNγ能反馈增强肿瘤细胞的铜死亡敏感性。

（六）铜死亡诱导剂上调PD-L1并与免疫检查点抑制剂协同

Cu²⁺离子载体处理MC38和EMT6肿瘤后，PD-L1表达增加。联合小鼠PD-L1阻断剂后，TME中CD8⁺和CD4⁺ T细胞激活显著增强，且与FDX1表达、铜积累、脂酰化和DLAT聚集相关。在多种免疫活性模型中均观察到类似协同效应，包括转移模型。更重要的是，多个接受ICIs治疗的癌症患者队列数据显示，治疗应答者的FDX1水平高于无应答者，且FDX1水平与总生存期正相关。

五、讨论与结论

讨论部分强调，铜死亡是一种真正的ICD形式，其免疫原性由DAMP释放、DC介导的T细胞启动和IFNγ驱动的FDX1上调前馈回路共同决定。该回路不仅增强铜死亡本身，还诱导PD-L1表达，为联合ICIs提供了坚实理论基础。研究者指出，诱导铜死亡可能将免疫学“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，从而克服ICIs原发性耐药。尽管小鼠中未观察到明显毒性，但多数实验周期较短；由于铜死亡涉及线粒体蛋白脂酰化，长期全身给药可能影响脑、肌肉和心脏等高代谢组织。特别是接受ICIs患者中罕见但严重的心肌炎风险，提示联合方案需要关注靶向递送和监测策略。

研究结论部分：Lei及其合作者优雅地证明，铜死亡是ICD的一种真正变体，它启动了一个基于IFNγ、依赖FDX1的放大回路，具有显著的免疫治疗效应。除了将铜死亡列入明显免疫原性RCD模式清单外，这些发现还表明诱导铜死亡可能构成一种有效方法，可强力炎症化免疫学“冷”恶性肿瘤的TME，从而使其对ICIs免疫治疗敏感。然而，临床可行的铜死亡诱导剂亟待开发，以在肿瘤患者中正式评估该策略的安全性和有效性。