高氧抑制小鼠前脑少突胶质前体细胞增殖但促进其分化

《ASN Neuro》：Hyperoxia Inhibits the Growth of Mouse Forebrain Oligodendrocyte Progenitors but Promotes Their Differentiation

　　

少突胶质细胞（Oligodendrocytes）介导跳跃式传导（saltatory conduction），并支持神经元和轴突的存活；因此，当其发生病变或损伤时，会引发神经系统问题。研究人员已成功利用磁珠法、免疫淘选法和差速贴壁法从啮齿动物中分离出少突胶质前体细胞（OPCs）。尽管大鼠OPCs易于体外扩增，但小鼠OPCs的体外扩增一直不顺利，考虑到小鼠被用于构建大多数基因工程疾病模型，这一问题亟待解决。在本研究中，研究人员开发并验证了一种可重复、简便的方法，用于制备大量近乎均一的小鼠OPCs培养物。采用McCarthy和de Vellis机械分离法，研究人员从混合胶质细胞中分离出OPCs，并将其接种于纤连蛋白（fibronectin）包被的培养板上，使用含有成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）和B104神经母细胞瘤条件培养基（B104 conditioned medium）的化学成分限定培养基进行培养。然而，当维持在标准组织培养孵箱中时，这些细胞增殖非常缓慢，约20%死亡。相比之下，当维持在含2%氧气的孵箱中时，它们增殖更快，并可多次传代扩增且保持高活力。经过三次传代后，超过99%的OPCs表达早期OPCs标志物。在仅含FGF-2的培养基中，它们进展为晚期OPCs。当提供补充有T3的培养基时，大部分OPCs分化为具有片状膜结构的O4+/MBP+少突胶质细胞。然而，在第3至第6次传代之间，只有不到20%的OPCs分化为MBP+少突胶质细胞，这与Sox-10的表达丢失有关。这些研究揭示了小鼠与大鼠OPCs之间的显著差异，以及氧张力在小鼠OPC增殖和分化中的作用。

论文解读文章

研究背景与目的

少突胶质细胞（Oligodendrocytes）是中枢神经系统（CNS）的髓鞘形成胶质细胞，对于介导神经元动作电位的跳跃式传导和支持轴突存活至关重要。少突胶质前体细胞（OPCs）起源于胚胎发育后期，经历多个不同的成熟阶段，可通过特定阶段表达的抗原加以区分。尽管已有多种从大鼠CNS中分离OPCs的成功方法，例如免疫淘选、荧光激活细胞分选（FACS）和磁珠分选（MACS），但将这些方法应用于小鼠时效果不佳。由于大多数转基因和基因敲除研究都在小鼠中进行，因此迫切需要开发一种简便、高效的方法来从小鼠中获得大量高纯度的OPCs，以便于研究脱髓鞘疾病如多发性硬化症等的病理机制和修复策略。

研究方法概述

研究人员首先采用McCarthy和de Vellis的机械分离法，从出生后0-2天（P0-P2）的C57BL/6小鼠端脑中制备混合胶质细胞培养物。随后，通过离心力震荡去除小胶质细胞和星形胶质细胞，富集OPCs。为了优化OPCs的扩增，研究人员比较了不同培养基配方（含PDGF-AA+FGF-2或B104神经母细胞瘤条件培养基（B104CM）+FGF-2）、不同基质（多聚-D-赖氨酸（PDL）或纤连蛋白（fibronectin））以及不同氧浓度（标准大气氧浓度约20%与生理性低氧2%）对细胞增殖和存活的影响。细胞表型通过免疫荧光染色和流式细胞术（检测NG2、PDGFRα、A2B5、O4、GLAST等标志物）进行评估。分化实验通过在撤去丝裂原后加入三碘甲状腺原氨酸（T3）诱导，并通过检测髓鞘碱性蛋白（MBP）和O4的表达来评估成熟度。细胞凋亡通过原位末端标记法（ISEL）检测。

研究结果

1. 小鼠OPCs可通过机械震荡法从新生小鼠前脑混合胶质细胞培养物中轻松分离

混合胶质细胞培养约10-12天后达到汇合，通过两次震荡（先1小时去除小胶质细胞，再18小时去除OPCs）可获得富含OPCs的细胞组分。该组分中的细胞主要为双极或三极形态。

2. 在生理氧（2% O₂）条件下，使用B104CM和FGF-2培养基可获得大量小鼠OPCs

初始使用PDGF-AA+FGF-2和PDL包被时，细胞难以传代。改用B104CM+FGF-2和纤连蛋白包被后，细胞可增殖但速度缓慢。当将氧浓度降至2%时，细胞增殖速率显著加快，可每4天传代一次，且产量大幅提高。在20%氧条件下，细胞凋亡率（18.7%±5%）远高于2%氧条件（7.2%±3%）。经三次传代后，OPCs纯度高达96.48%±3.6%（A2B5⁺）。值得注意的是，大鼠OPCs的生长不受氧浓度影响，且在2%氧下倾向于聚集形成球体。

3. 在生理氧条件下使用B104+FGF-2培养时，OPCs主要为A2B5⁺和Ki67⁺

在不同细胞密度（3x10⁴ cells/cm²和6x10⁴ cells/cm²）下培养4天后，大多数细胞仍维持早期祖细胞表型（A2B5⁺），且增殖指数（Ki67⁺细胞比例）很高，接近Olig2⁺细胞数。

4. 丝裂原对培养的OPCs表型具有差异性影响

与PDGF-AA+FGF-2组合相比，单独使用FGF-2培养96小时后，细胞数量未显著增加，且表达O4的晚期祖细胞比例更高（19%±0.04 vs. 8%±0.01）。此外，约40%在FGF-2单独培养下的细胞既不表达A2B5也不表达O4，但表达Olig2和GFAP，表明其向星形胶质细胞分化。

5. 在B104+FGF-2和2% O₂条件下培养时，OPCs随时间推移沿少突胶质细胞谱系进展

流式细胞术分析显示，在第3和第6次传代时，99%的细胞表达NG2和PDGFRα，且不表达神经干细胞标志物CD133/LeX。然而，O4的表达从第3次传代的17%急剧上升至第6次传代的98%。同时，谷氨酸天冬氨酸转运体（GLAST）的表达也从少量增加至68%。

6. 在超生理氧条件下，OPCs可在体外分化为成熟的髓鞘化少突胶质细胞，但反复传代后大部分丧失分化能力

将第3次传代（P3）的OPCs置于含T3的分化培养基中，并在20%氧条件下培养7天，63%±10%的细胞成为MBP⁺细胞，并形成复杂的片状膜结构。而第6次传代（P6）的OPCs在相同条件下，80.8%±10%的细胞仍为MBP阴性，且Sox-10和Olig2表达也显著降低。

7. 小鼠OPCs在第3至第6次传代间失去Sox-10表达和分化能力

研究发现，随着传代次数增加，Sox-10阳性细胞的比例从P0的60%±0.09下降至P3的23%±0.03，并在P6维持在此低水平（约25%）。这种Sox-10的丢失与P6细胞分化能力的丧失密切相关，表现为MBP阳性细胞比例的显著下降。

讨论与结论

本研究建立了一种从小鼠新生脑中纯化和扩增大量OPCs的简易方法。关键改进在于使用B104CM+FGF-2作为丝裂原组合，以纤连蛋白作为基质，并将培养环境氧浓度控制在生理性低氧水平（2% O₂）。低氧环境显著促进了小鼠OPCs的增殖并减少了细胞死亡，这可能是通过稳定缺氧诱导因子1α（HIF1α）实现的。然而，长期在低氧下培养会导致OPCs逐渐成熟（O4表达增加）并最终丧失分化能力，这与Sox-10转录因子的表达下调有关。研究还发现，在20%的超生理氧条件下，虽然不利于细胞增殖，却能有效促进OPCs向成熟MBP⁺少突胶质细胞的分化。

结论部分翻译：研究结果表明，可以利用一种相对简单直接的方法制备富集的小鼠脑OPCs培养物。值得注意的是，除了提供合适的丝裂原外，小鼠OPCs对环境氧浓度极为敏感。为了维持小鼠OPCs的增殖能力，必须将其置于提供2% O₂、5% CO₂和93% N₂的三气培养箱中。在此条件下，小鼠OPCs将大量增殖，并且当撤除丝裂原后，大部分细胞可分化为具有广泛片状膜的MBP⁺少突胶质细胞；然而，超过3次传代后，它们开始丧失分化为MBP⁺少突胶质细胞的能力。