《Foods》：Longitudinal Multi-Batch Characterisation of Beer Wort Fermentation Foam Using Image-Based Semantic Segmentation
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本研究采用原位（in situ）和体外（in vitro）模型试验，结合理化分析、多光谱技术、分子对接（molecular docking）和分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟，探究了咖啡酸（caffeic acid, CA）对肉类
本研究采用原位（in situ）和体外（in vitro）模型试验，结合理化分析、多光谱技术、分子对接（molecular docking）和分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟，探究了咖啡酸（caffeic acid, CA）对肉类的护色效应及其与肌红蛋白（myoglobin, Mb）的互作机制。研究选用三头24月龄西门塔尔杂交阉牛胴体，制备12块牛排（每头4块）。牛排被分为三个处理组：对照组（去离子水）、0.05%（w/v）CA组和0.1%（w/v）CA组。样品在4±0.5°C条件下贮藏7天，模拟零售展示环境，并用聚氯乙烯（polyvinyl chloride, PVC）薄膜包裹。贮藏实验表明，0.1% CA显著延缓牛肉褐变并维持其红色。理化分析显示，CA抑制高铁肌红蛋白（metmyoglobin, MetMb）形成达6%，降低Mb溶解度，并将表面疏水性减少约90%。荧光光谱证实，CA与Mb之间的相互作用由氢键和范德华力驱动，表现为静态猝灭机制，在293 K下结合常数为259.41×103 L/mol。此外，紫外-可见（UV-Vis）和傅里叶变换红外（FT-IR）光谱表明，CA结合后Mb发生结构调整。差示扫描量热法（differential scanning calorimetry, DSC）显示热变性温度升高。原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）显示CA诱导Mb聚集。分子对接和MD模拟结果一致表明，CA主要通过非共价相互作用（如氢键）与Mb分子结合。综上，这些发现为CA作为天然肉制品护色剂的应用提供了理论基础。
研究背景与意义
肉色是消费者判断肉类新鲜度和品质的重要指标，鲜亮的红色通常促进销售，而褐变则导致严重的经济损失。据报道，美国每年因肉色劣变造成的经济损失超过10亿美元。肉色主要由肌肉中肌红蛋白（myoglobin, Mb）的含量和化学状态决定。屠宰后，Mb主要以脱氧肌红蛋白（deoxymyoglobin, Fe2?，呈紫红色）、氧合肌红蛋白（oxymyoglobin, Fe2?-O?，呈鲜红色）和高铁肌红蛋白（metmyoglobin, MetMb, Fe3?，呈褐色）三种形式存在。维持鲜红色的关键在于抑制MetMb的形成。
传统的肉色保护策略包括真空包装、高氧气调包装等物理方法，以及亚硝酸盐、有机酸盐等化学方法。然而，真空包装会导致不讨喜的紫红色，高氧气调包装成本较高，而亚硝酸盐等合成添加剂的安全性日益受到关注。近年来，植物多酚因其天然、安全的抗氧化特性成为研究热点。咖啡酸（caffeic acid, CA）是一种天然的羟基肉桂酸类酚酸，其邻二酚羟基结构赋予其强大的自由基清除和金属螯合能力。已有研究表明CA有助于稳定肉色，但其与Mb的具体非共价结合机制尚未被系统阐明。因此，研究人员开展本研究，旨在从分子层面揭示CA与Mb的结合方式、驱动力及其对肉色稳定性的影响，为开发新型天然肉色保护剂提供理论依据。
研究方法概述
研究人员采用原位贮藏实验和体外模型相结合的策略。原位实验选取三头24月龄西门塔尔杂交阉牛的背最长肌，制备12块牛排，分别用去离子水（对照）、0.05% CA和0.1% CA浸泡处理，在4°C、模拟零售光照条件下贮藏7天。体外实验则利用马骨骼肌来源的纯化Mb与不同浓度CA（0–100 μM）孵育。关键技术方法包括：紫外-可见分光光度法测定MetMb相对含量；溴酚蓝（bromophenol blue, BPB）探针法测定表面疏水性；差示扫描量热法（DSC）评估热稳定性；傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析二级结构变化；内源荧光光谱和同步荧光光谱研究结合机制、结合常数和热力学参数；原子力显微镜（AFM）观察微观形貌；分子对接（CB-Dock2）预测结合位点；以及100 ns全原子分子动力学模拟（MD，Amber03力场，TIP3P水模型）验证复合物的动态稳定性。
研究结果
3.1 CA对肉色的保护效果分析
通过7天贮藏实验的照片和色度参数（L, a, b）测量发现，所有组别均出现颜色劣变，但CA处理组，尤其是0.1% CA组，显著延缓了牛肉褐变。在贮藏第5天和第7天，CA处理组的红度值（a）显著高于对照组，表明CA有效维持了肉的红色。
3.2 MetMb%、溶解度、表面疏水性和DSC分析
MetMb含量测定显示，CA处理后MetMb比例呈剂量依赖性下降，12.5–100 μM CA处理组MetMb含量显著低于对照组。溶解度实验表明，CA导致Mb溶解度从约90%（0 μM）显著降至约60%（100 μM）。表面疏水性分析显示，BPB结合量随CA浓度增加单调递减，在100 μM CA时较对照组减少约90%。DSC结果显示，纯Mb的热变性峰值温度（Tmax）为82.37°C，而加入100 μM CA后升至132.95°C，增幅达61.41%，表明CA显著增强了Mb的热稳定性。
3.3 荧光光谱分析
内源荧光光谱显示，随着CA浓度增加，Mb在340 nm处的荧光强度规律性下降，且无峰位移动。Stern-Volmer图和计算得到的双分子猝灭速率常数（Kq，数量级1012 L/(mol·s)）远大于扩散控制极限，证明猝灭机制为静态猝灭，即CA与Mb形成基态复合物。结合常数（Ka）随温度升高而减小，在293 K时为259.41×103 L/mol，表明高温不利于复合物形成。结合位点数（n）接近1，表明存在一个主要结合位点。热力学参数（ΔG<0，ΔH<0，ΔS<0）表明结合过程自发进行，氢键和范德华力是主要驱动力。
3.4 FTIR、UV-Vis吸收光谱和同步荧光光谱分析
FT-IR显示，CA引起Mb的酰胺I带和酰胺II带发生轻微位移和强度变化，表明CA改变了Mb的二级结构氢键网络。UV-Vis光谱中，Mb的Soret带（约409 nm）吸光度显著下降，280 nm处吸光度也降低，表明CA影响了血红素辅基和芳香族氨基酸残基的微环境。同步荧光光谱（Δλ=15 nm反映酪氨酸Tyr，Δλ=60 nm反映色氨酸Trp）显示，CA导致Tyr和Trp残基的荧光猝灭并伴随蓝移，表明其微环境极性降低、疏水性增强。
3.5 AFM分析
AFM图像显示，纯Mb分子呈均匀分散的球状颗粒。低浓度CA（3.125–12.5 μM）诱导初始聚集，表面粗糙度和高度增加。高浓度CA（25–100 μM）导致大规模聚集甚至纤维状结构的形成，在100 μM时形成致密的大颗粒堆叠，最大高度达39 nm。
3.6 分子对接和分子动力学模拟分析
分子对接显示CA嵌入Mb的疏水空腔，与Lys87、Glu148、Asn145等残基形成氢键，并与Ala81、His82、Asp141等产生疏水接触。100 ns MD模拟进一步验证了复合物的动态稳定性：RMSD曲线显示CA结合后Mb骨架稳定性增强；RMSF表明未诱导剧烈构象扰动；持续稳定的氢键数目（0–6个）支持了对接结果；回转半径（Rg）略小于纯Mb，表明结构更紧凑；溶剂可及表面积（SASA）分析显示疏水SASA降低、亲水SASA升高；自由能形貌（FEL）显示复合物存在一个深而窄的全局能量最小值（约-40 kJ/mol），代表最热力学稳定的状态。
讨论与结论总结
讨论部分指出，CA通过三条途径发挥护色作用：直接清除自由基中断氧化链反应；与Mb直接结合稳定其构象，抑制MetMb形成；在还原剂存在下协同还原MetMb。溶解度和表面疏水性的变化表明CA与Mb发生特异性结合，改变了蛋白的表面性质。DSC数据提供的热力学证据证实CA显著提高了Mb的结构刚性。荧光、FTIR和UV-Vis光谱一致证实了非共价结合的存在，并明确了氢键和范德华力的主导地位。AFM直观展示了CA诱导的Mb聚集行为。MD模拟从原子层面揭示了CA结合使Mb变得更稳定、更紧凑。
结论部分翻译如下：本研究全面证明了CA通过氢键、疏水作用和静电相互作用等非共价方式与Mb结合，从而调节Mb的结构和功能。主要发现包括：在肉类贮藏实验中，0.1% CA有效保持了肉的鲜红色并延缓褐变，其机制涉及清除自由基和减少脂质过氧化。CA保护了疏水区域（BPB结合量减少90%），同时增强了亲水性，改变了Mb的溶剂化性质。这种表面结构重组与CA抑制MetMb形成（最多减少6%）有关。荧光光谱和分子对接确定了特定结合残基（如Glu148、Asn145和His82），并确认了约1:1的摩尔比，范德华力和氢键为主要驱动力。CA增强了Mb的整体刚性，降低了RMSD（0.1 nm）并提高了热稳定性（100 μM CA时Tmax=132.95°C）。MD模拟揭示CA限制了构象漂移，稳定了一个具有更低自由能（-40 kJ/mol）的紧凑结构。该研究为基于多酚的肉色保护策略建立了分子框架，突出了CA作为天然多功能添加剂替代合成化合物的潜力，为开发可持续的肉色保持技术提供了蓝图。
