基于嗅觉受体OR5K1的电化学生物传感器用于食品中吡嗪类化合物检测及分子识别机制研究

《Foods》：Development of an Olfactory Receptor (OR5K1)-Based Biosensor for Pyrazine Detection in Foods

　　

吡嗪类化合物是食品中赋予焙烤与坚果香气特征的关键气味物质。为提高实用性，研究人员以嗅觉受体OR5K1为识别元件，以AuNPs-PB/ZIF-8@SWCNT/Ti₃C₂ MXene为传感基质，开发了一种新型电化学嗅觉生物传感器用于吡嗪分析。通过分子对接和计算机模拟定点突变（in silico site-directed mutagenesis），研究人员探索了OR5K1对吡嗪类化合物的传感应用及分子识别机制。该传感器的线性检测范围为10^?14至10^?9 M，检测限低至10^?14 M。与干扰物质（包括乙醇、己醛、丙酮和苯酚）相比，该生物传感器对吡嗪类化合物表现出显著更高的电流响应，显示出优异的选择性；储存12天后仍保留初始信号的79%，表明其具有良好的稳定性。吡嗪存在时还原峰电流的变化值（ΔI）被用作分析信号。当应用于四种麦芽样品（皮尔森麦芽、慕尼黑麦芽、结晶麦芽和焦糖麦芽）时，该生物传感器的ΔI响应范围为4.6 ± 0.2 μA至108 ± 6 μA，与GC-TOF/MS测定的总吡嗪含量（0.092–0.391 mg/kg）对应良好，相关系数为0.96。分子对接显示结合能为?3.9至?6.0 kcal/mol，表明OR5K1与吡嗪之间存在自发相互作用，Leu14、Met81、Asn84、Phe17、Phe85和Lys90被确定为潜在关键残基，氢键、疏水相互作用及π?π堆积是主要驱动力。该工作为吡嗪检测提供了一种灵敏且选择性的生物传感器，所阐明的识别机制为理解焙烤香气感知提供了分子基础，并支持其在食品质量控制与风味分析中的应用。总体而言，该研究为设计基于嗅觉受体的电化学生物传感器提供了新见解，并推动了未来食品香气-受体相互作用机制的探索。

吡嗪类化合物是咖啡、啤酒麦芽、肉类和中国白酒等食品中重要的香气贡献物，具有极低的气味阈值，常作为评估食品感官质量的指标。传统检测方法如气相色谱-质谱联用（GC-MS）和气相色谱-飞行时间质谱联用（GC-TOF/MS）虽然准确，但设备昂贵、缺乏便携性且操作复杂；商品化电子鼻和基于导电纳米材料的气体传感器则因依赖非特异性相互作用而选择性不足。嗅觉受体（Olfactory Receptor, OR）作为气味识别的最初元件，具有天然的高特异性和高灵敏度。OR5K1是近年发现的专一性识别吡嗪类化合物的人类嗅觉受体，但其与吡嗪分子的结合机制尚未见报道。为此，研究人员旨在开发一种基于OR5K1的新型电化学嗅觉生物传感器，用于吡嗪化合物的高灵敏、高选择性检测，并通过分子模拟阐明OR5K1与吡嗪的相互作用机制。该研究填补了吡嗪化合物“靶向识别”的空白，为理解吡嗪相关焙烤香气的分子基础提供依据。

研究人员将人类嗅觉受体OR5K1在酿酒酵母菌株DJO1中异源表达，并制备含受体的纳米囊泡（Nanovesicles, NVs）。利用AuNPs-PB/ZIF-8@SWCNT/Ti₃C₂ MXene复合材料修饰玻碳电极，通过电沉积将NV–AuNP–PB复合物固定到电极表面，构建了完整的电化学嗅觉生物传感器。该传感器对2,3,5-三甲基吡嗪（TMP）在10^?14至10^?9 M范围内呈现良好线性响应，检测限达10^?14 M，并具有优异的选择性和稳定性。应用于四种不同焙烤程度的麦芽样品时，传感器电流响应与GC-TOF/MS测定的总吡嗪含量高度相关（r=0.96）。分子对接和计算机模拟定点突变表明，OR5K1与吡嗪类化合物的结合是自发的，Leu14、Met81、Asn84、Phe17、Phe85和Lys90是关键残基，氢键、疏水相互作用和π?π堆积为主要驱动力。该研究不仅提供了一种实用的吡嗪检测工具，还为基于嗅觉受体的电化学生物传感器设计和食品香气-受体相互作用研究提供了新思路。

本研究采用的主要关键技术方法包括：①在酵母DJO1中异源表达OR5K1并制备纳米囊泡；②合成ZIF-8@SWCNT复合材料、AuNPs和Ti₃C₂ MXene，并逐层修饰电极；③利用循环伏安法（CV）和差分脉冲伏安法（DPV）表征电化学行为并检测吡嗪；④对四种麦芽样品（皮尔森麦芽、慕尼黑麦芽、结晶麦芽和焦糖麦芽）进行乙醇提取，用GC-TOF/MS定量吡嗪；⑤采用AlphaFold 3预测OR5K1三维结构，AutoDock进行分子对接，PyMOL进行计算机模拟定点突变。

### 3.1 基于NV–AuNP–PB/ZIF-8@SWCNT/Ti₃C₂ MXene的嗅觉生物传感器的表征

**3.1.1 嗅觉受体的表征**：Western blot分析显示，在酵母细胞和酵母来源的纳米囊泡中均在35 kDa处出现OR5K1条带，证实OR5K1成功表达。

**3.1.2 纳米材料的表征**：扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）显示ZIF-8颗粒原位生长在SWCNT表面，形成项链状结构，粒径为330–550 nm；能谱（EDS）mapping证实Zn、O、C、N元素均匀分布。Ti₃C₂ MXene呈多层薄片状，具有高纯度和典型二维纳米材料特征。

### 3.2 嗅觉生物传感器的电化学行为表征

CV和DPV结果表明，Ti₃C₂ MXene可增加峰电流，ZIF-8@SWCNT修饰后峰电流下降，AuNP–PB电沉积后峰电流显著升高，而NV和BSA修饰后峰电流降低，TMP孵育后峰电流进一步下降，证明传感器成功构建且具有响应能力。

### 3.3 吡嗪检测条件优化

通过单因素优化确定了最佳实验条件：Ti₃C₂ MXene浓度为0.3 mg/L，ZIF-8与SWCNT质量比为6:1，电沉积扫描圈数为15圈，受体浓度（纳米囊泡浓度）为0.5 mg/mL，孵育时间为40 min。

### 3.4 吡嗪化合物检测的性能分析

在最佳条件下，DPV响应显示ΔI随TMP浓度（10^?14–10^?9 M）增加而增大，校准方程为ΔI(μA) = (?11.60 ± 0.55)pC + (164.4 ± 6.0)，相关系数0.9889，检测限为10^?14 M（3σ/S准则）。

### 3.5 嗅觉生物传感器的选择性、稳定性和重复性

该传感器对吡嗪、TMP、TTMP、2,6-DMeP、2,3-DMeP和2,5-DMeP的电流响应显著高于对乙醇、己醛、丙酮和苯酚等干扰物的响应。对苯酚的响应相对较高，可能因其苯环结构与吡嗪相似。传感器在4°C储存12天后保留初始信号的79%。同批制备的电极响应电流无显著差异，相对标准偏差（RSD）为2.54%，表明重复性良好。

### 3.6 真实样品分析

四种麦芽样品的GC-TOF/MS分析共鉴定出211种挥发性有机物，其中杂环化合物种类和含量最高。总吡嗪含量随焙烤程度加深而增加，顺序为皮尔森麦芽<慕尼黑麦芽<结晶麦芽<焦糖麦芽。传感器ΔI响应与GC-TOF/MS总吡嗪含量高度相关（r=0.96），其中焦糖麦芽ΔI为108 ± 6 μA（含量0.39 ± 0.02 mg/kg），皮尔森麦芽ΔI为4.6 ± 0.2 μA（含量0.092 ± 0.004 mg/kg）。

### 3.7 嗅觉受体结构评估

AlphaFold 3预测的OR5K1结构经Ramachandran图评估，93.3%残基位于最允许区域，6.7%位于额外允许区域，无不合理区域，表明模型质量可靠，适用于分子对接。

### 3.8 分子对接结果分析

OR5K1与六种吡嗪化合物的结合能为?3.9至?6.0 kcal/mol，均为自发反应。TMP结合能最低（?6.0 kcal/mol），亲和力最强；吡嗪结合能最高（?3.9 kcal/mol），亲和力最弱，与电化学响应趋势一致。氢键和疏水相互作用是主要驱动力，Leu14和Met81易形成氢键，Thr18、Asn84、Phe177、Phe17、Phe85和Lys90介导疏水相互作用，吡嗪的苯环结构还参与π?π堆积，增强结合稳定性。

### 3.9 计算机模拟定点突变结果分析

将关键残基突变为丙氨酸或甘氨酸后，OR5K1对吡嗪、TMP和2,5-DMeP的结合亲和力普遍降低。其中Leu14Ala突变使TTMP结合能从?4.6 kcal/mol升至?4.3 kcal/mol，并破坏氢键网络。结果证实Leu14、Met81、Asn84、Phe17、Phe85和Lys90是OR5K1识别吡嗪的关键结合位点。

在讨论部分，研究人员指出纳米复合材料中ZIF-8提供高比表面积以负载受体，SWCNT弥补ZIF-8导电性不足，MXene增强电极导电性和成膜性，AuNPs与PB协同促进电子传递并维持受体活性。分子模拟结果与电化学实验相互印证，表明传感器响应不仅受结合亲和力影响，还与结合动力学、分子取向和质量传递效率等因素有关。计算机模拟定点突变进一步验证了关键残基的作用，但所识别的残基和机制仍需要体外和体内实验验证。研究结论为：本研究成功开发了基于嗅觉受体OR5K1的电化学生物传感器，用于检测吡嗪类化合物。将OR5K1与AuNP–PB/ZIF-8@SWCNT/Ti₃C₂ MXene纳米复合材料整合，能够在标准溶液和真实麦芽样品中实现灵敏、选择性的吡嗪检测，展示了基于受体的生物传感器在食品风味分析中的潜力。分子对接和计算机模拟定点突变预测Leu14、Met81、Asn84、Phe17、Phe85和Lys90是参与吡嗪识别的关键残基，氢键、疏水相互作用和π?π堆积是主要驱动力。这些计算发现为理解吡嗪相关焙烤香气的识别机制提供了分子基础，并可能指导未来基于结构的香气化合物筛选。尽管结果令人鼓舞，但仍存在一些局限性：该生物传感器目前仅适用于液相检测，识别残基和相互作用机制源于计算预测，仍需体外和体内实验验证。未来工作将集中于将该传感器小型化为便携式设备，扩展选择性评估以包括吡啶和吡咯等其他杂环化合物，并在更广泛的食品基质中验证其性能。经过进一步优化，这种仿生传感平台有望用于现场、快速、准确的风味分析，为食品行业的智能质量监测和控制做出贡献。总体而言，该研究不仅为吡嗪检测提供了实用工具，还为嗅觉受体-配体相互作用提供了机制见解，为开发用于食品风味分析的下一代生物电子传感器铺平了道路。