微塑料显微光谱分析中基于先验信息的子采样方法评估

《Toxics》：Evaluation of Subsampling Methods for Micro-Spectroscopy Analysis of Microplastics

　　

对环境滤膜样品中微米级微塑料（MPs）进行全显微光谱分析可能非常耗时。子采样是必要的，但会引入关于滤膜上收集到的微塑料数量、质量及类型的不确定性。常用的随机和分层随机子采样对样品信息的利用极少，本研究将二者与利用快速先导扫描获得的收集微塑料颗粒数目和尺寸分布的子采样方法进行了比较。这些信息化子采样方法通过接近平均计数（PMC）、接近平均尺寸（PMS）、接近高计数区域（PPC）和接近大尺寸区域（PPS）来偏向子采样。通过蒙特卡洛模拟，将这些信息化子采样方法与随机和分层方法进行了基准比较，涉及三个指标：（1）计数估计，（2）尺寸分布表征，以及（3）识别表征。对于计数估计，PMC方法略优于随机方法。对于尺寸和识别表征，PMS优于所有其他方法。为重申所提方法的实用性，展示了一项基于PMC和PMS执行子采样并估计微塑料总体数量、尺寸和识别的研究。本研究结果为应用利用颗粒数目和尺寸分布而非随机子采样的子采样方法提供了强有力的论据。

微塑料（microplastics, MPs）是指尺寸在1 μm至5 mm之间的合成聚合物颗粒，广泛存在于生态系统、食品及生物组织中，对环境和人类健康构成潜在风险。对微塑料的显微光谱分析（micro-spectroscopy）可提供颗粒的类型、计数、形状和尺寸信息，但该技术极为耗时，单个滤膜可能含有多达10⁴个颗粒，完整分析需要数天甚至更长时间。为缩短分析时间，研究者常采用子采样（subsampling）策略，即分析滤膜的一部分区域并外推至全滤膜。然而，现有子采样方法存在明显局限：无先验信息的随机或分层随机子采样对样品信息利用极少，准确性受颗粒分布均匀性影响；系统性子采样（如楔形、十字、螺旋、网格）则可能因颗粒聚集导致系统性偏差。虽有研究提出基于认知先验或经验先验的策略，但尚未有系统性地利用先导扫描（pilot scan）获得的颗粒数目和尺寸分布信息来指导子采样位置及估算的方法。因此，研究人员旨在设计并验证基于先验信息的子采样方法，以在保证估算准确性的前提下大幅减少分析工作量。

研究人员制备了由低密度聚乙烯（LDPE）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚苯乙烯（PS）和聚氯乙烯（PVC）组成的标准聚合物滤膜，并通过不同滴加方式形成三种颗粒分布特征（#1中心集中、#2四象限分散、#3均匀分布）；环境样品取自污水处理厂生物固体，经H₂O₂消化和密度分离后收集到玻璃纤维滤膜上。采用光学光热红外光谱（O-PTIR）系统进行先导扫描，基于荧光成像自动获取颗粒计数和尺寸，并通过红外光谱鉴定聚合物类型。六种子采样方法——随机（Random）、分层随机（Stratified）、接近平均计数（PMC）、接近平均尺寸（PMS）、接近高计数区域（PPC）和接近大尺寸区域（PPS）——在1000次蒙特卡洛（Monte Carlo, MC）模拟中进行了比较。计数估计采用平均相对误差（MRE）作为指标；尺寸分布表征采用跨度MRE、相对标准偏差（RSD）和Spearman系数；识别表征采用平均绝对误差（MAE）、RSD和Spearman系数。子采样规模设为约占总采样位置的10%。

**3.1 标准聚合物过滤器**
三种标准聚合物滤膜表现出不同的计数变异性和空间相关性（以变异系数CV和Moran's I表征），并具有不同的局部假阳性率（FPR）及其RSD，为方法比较提供了多样的颗粒分布场景。

**3.2 计数估计**
MC模拟结果显示，PMC在多数滤膜上取得了略优于随机方法的计数MRE（约15%–20%），而PPC因对局部FPR的高度波动敏感，表现最差，尤其在FPR不一致性高的滤膜上出现严重偏差。当颗粒分布高度极化（CV极高）时，PMC可用的中等计数位置减少，导致代表性下降，但总体而言，PMC被选为计数估计的首选方法。

**3.3 尺寸分布表征**
PMS在准确度（跨度MRE<20%）、精密度（RSD<10%）和尺寸秩保真度（Spearman系数>0.9）上均显著优于其他所有方法，且在各滤膜上表现稳定。PPS次之，但因其基于颗粒总尺寸的采样策略，容易受到少数大颗粒或大量小颗粒等边缘情况的干扰。随机和分层方法在所有指标上均明显落后。

**3.4 识别表征**
PMS在聚合物类型比例估计上同样表现最佳，这主要归因于大数定律（law of large numbers, LLN）：PMS倾向于选择高颗粒数量的位置，使样本中的聚合物类型频率分布更易收敛至全局真值。PPC和PPS由于采用Hájek估计器，在计算中抹平了高计数位置的优势，未能充分利用LLN。PMC因仅选择接近平均计数的位置，可能遗漏高计数关键位置，在部分滤膜上表现不可靠。

**3.5 环境样品**
在生物固体滤膜上（约500个采样位置，FPR达98%，CV>200%，Moran's I>0.58），MC模拟显示PPC在计数估计中的MRE略低于PMC，但PPC的性能高度依赖极端计数分布，且对FPR波动敏感，因此PMC仍被推荐用于计数估计。PMS在尺寸和识别表征中继续领先。演示实验使用PMC和PMS，基于50个子采样位置（约10%面积），估计总颗粒数为393（真实值396）；对<50 μm颗粒（占总数的98%）的尺寸秩预测准确，各尺寸段比例误差<25%；主要聚合物类型的计数误差<10%，前六种聚合物总计数估计为355（真实值356）。整个过程耗时约2.5小时，而全滤膜分析预计需约250小时，即节省了约100倍时间。

讨论部分强调了基于先验信息的子采样方法相较于盲目随机方法的优势，特别是PMS在尺寸和识别表征中的一致优越性，以及PMC在计数估计中的稳健性。研究结论指出：在微塑料显微光谱分析中，推荐采用基于先验信息的子采样方法，具体为应用PMC进行总体颗粒数估计，应用PMS进行颗粒尺寸和识别特征分析。该策略通过快速先导扫描获取颗粒数量和尺寸分布，然后据此指导子采样位置，可显著减轻分析的时间瓶颈，且具有在不同分析平台上的高度可移植性。