液相色谱-串联质谱法测定红曲米及其相关产品中的米酵菌酸和异米酵菌酸

《Toxins》：Determination of Bongkrekic Acid and Iso-Bongkrekic Acid in Red Yeast Rice and Its Related Products by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

　　

米酵菌酸（Bongkrekic acid, BA）是一种对人类具有致命性的代谢产物，由含有bon基因簇的唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans, BGC）产生。研究人员建立了一种采用液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）测定深度发酵米制品（如红曲米及其相关产品）中BA及其立体异构体异米酵菌酸（iso-bongkrekic acid, IBA）的分析方法。样品中的BA和IBA采用含1%氨水的80%甲醇/水溶液进行超声辅助提取，经阴离子交换柱固相萃取（solid-phase extraction, SPE）净化，采用XBridge^TM BEH C18色谱柱（150 mm × 3.0 mm, 2.5 μm）分离，通过质谱/质谱（MS/MS）检测，并使用同位素标记内标进行定量。研究人员对提取溶剂、超声提取时间及SPE净化过程中的上样体积等影响因素进行了优化，以提高BA和IBA的回收率。此外，还探讨了模拟质控样品与直接加标样品的提取效率差异、使用不同色谱柱时的基质效应、不同流动相组成下共流出干扰物质的影响以及BA向IBA的转化问题。BA和IBA的线性范围为0.1–50 ng/mL（相当于样品中1–500 μg/kg），相关系数超过0.999。检测限和定量限分别为0.3–0.5 μg/kg和1.0–1.5 μg/kg。在红曲米及其相关产品中，三个加标水平下分析物的平均回收率为88.4%–107%，相对标准偏差（relative standard deviations, RSDs, n = 6）为2.9%–11.8%。该优化方法已应用于市售样品中BA和IBA污染情况的研究。本研究可为红曲米及其相关产品中BA和IBA的监督管理和风险评估提供技术支持。

米酵菌酸（Bongkrekic acid, BA）是由含有bon基因簇的唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans, BGC）产生的一种对人类具有致命性的代谢产物。BA是线粒体ATP/ADP载体的高效高选择性抑制剂，主要作用于线粒体内膜，通过抑制腺嘌呤核苷酸转位酶诱导线粒体功能障碍。BA对小鼠的口服半数致死剂量（LD₅₀）为3.16 mg/kg，对成年人体的最低致死剂量仅为1–1.5 mg，是食源性中毒事件中致死性最强的生物毒素之一。易受BA污染的典型食品包括发酵米制品和玉米粉制品、椰子、银耳和黑木耳等。2020年中国黑龙江省发生因摄入受BA污染的酸汤子导致9名患者全部死亡的中毒事件；2024年中国台湾地区发生由未发酵米制品引起的33人中毒、死亡率为18.2%的BA中毒事件。中国仅对银耳中的BA设定了0.25 mg/kg的最大限量，其他食品尚未设定BA限量。红曲米是一种深度发酵米制品，在亚洲传统上用作调节胆固醇的膳食补充剂，也常与纳豆等食品复配制成红曲相关保健食品，还可用于提取红曲红色素作为食品添加剂。2023年底至2024年初，日本报告了与特定红曲（Beni-koji）片相关的肾功能障碍中毒事件，对此类发酵食品中生物毒素污染的食物安全风险提出了新挑战。发酵米制品是BGC的主要载体和培养基之一，红曲米及其相关产品存在BA污染的可能性，然而以往关于该基质中BA和异米酵菌酸（iso-bongkrekic acid, IBA）污染的研究报道较少。

研究人员建立并优化了一种采用碱性甲醇/水提取结合阴离子交换固相萃取（solid-phase extraction, SPE）净化、液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）测定红曲米及其相关产品中BA及其立体异构体IBA的分析方法。该方法简单快速，优化后的色谱分离条件可有效改善基质中共流出物质的干扰，确保定量结果的准确性，并已成功应用于市售样品的污染调查，可为红曲米及其相关产品中BA和IBA的监督管理和风险评估提供技术支持。

研究人员采用含1%氨水的80%甲醇/水溶液超声提取40 min，以PAX阴离子交换固相萃取柱（60 mg/3 mL）净化（上样体积0.5 mL），采用XBridge^TM BEH C18色谱柱（150 mm × 3.0 mm, 2.5 μm）分离，LC-MS/MS多反应监测模式检测，以¹³C₂₈-BA为同位素标记内标定量。样品包括80份红曲米产品、26份红曲保健食品和29份红曲红色素样品，购自当地市场或电商平台。

**提取溶剂的选择**

研究人员比较了含1%氨水的100%–70%甲醇/水溶液对加标红曲米（SP）和质控样品（QC-A、QC-B、QC-C）中BA和IBA的提取回收率。加标样品在100%–70%甲醇/水条件下回收率均超过90%；但质控样品在提取溶剂中不加水时回收率低于70%，加入水后回收率提高，使用80%甲醇/水时超过90%。这说明对于干燥基质，直接加标无法真实评价提取效率，因为实际样品中分析物被包裹在干燥基质内部，需水辅助提取使甲醇渗透入内。天然污染样品验证结果的相对偏差低于10%。最佳提取溶剂确定为含1%氨水的80%甲醇/水溶液。

**超声提取时间的选择**

研究人员考察了20–50 min超声提取时间对SP和QC样品回收率的影响。SP样品在20–50 min内回收率均超过90%，但QC-A和QC-B在20 min时低于80%。40 min时所有QC样品回收率均超过90%，天然污染样品验证结果相对偏差低于10%。最佳超声提取时间确定为40 min。

**SPE净化上样体积的优化**

研究人员优化了PAX柱净化时上样体积（0.2–1.0 mL）。1.0 mL时QC-A和QC-B中回收率为63.4%–85.5%，QC-C仅为31.5%–34.7%；0.5 mL时QC-A和QC-B超过90%，QC-C为72.1%–79.1%；0.2 mL时QC-C超过80%。深度发酵基质中存在大量具有羧基、表现阴离子交换功能的干扰物质，1.0 mL上样体积会导致SPE柱过载而降低回收率。综合考虑选择0.5 mL，QC-C中的损失可由内标校准校正。

**流动相的选择**

使用0.1%甲酸水溶液-乙腈流动相时，红曲米样品中BA存在明显的共流出基质干扰峰和显著的基质抑制效应。在水相中加入甲酸铵可改善BA与干扰物质的分离，1 mmol/L时效果最佳，但会降低分析物仪器响应。最终选择含0.1%甲酸和1 mmol/L甲酸铵的水溶液作为流动相水相。

**基质效应与色谱柱的选择**

研究人员比较了100 mm和150 mm两种长度C18色谱柱的基质效应。100 mm柱时三种基质中BA和IBA的基质效应为47.2%–70.3%，红曲红色素中约一半信号被抑制；150 mm柱时改善至78.8%–88.6%。因此选择150 mm色谱柱进行分离。

**方法验证**

BA和IBA在0.1–50 ng/mL（相当于样品中1–500 μg/kg）范围内线性良好，相关系数分别为0.9990和0.9993。红曲红色素中检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.5 μg/kg和1.5 μg/kg，其他基质中分别为0.3 μg/kg和1.0 μg/kg。三个加标水平下，红曲米中平均回收率为92.2%–107%（RSD为4.0%–8.9%），纳豆红曲保健食品中为92.8%–97.1%（RSD为2.9%–6.4%），红曲红色素