基于PacBio 16S rRNA全长测序解析有机废弃物施用对土壤微生物群落结构与演替的影响

《Environments》：Spatial Coherence and Non-Stationary Drought Dynamics in Water Management Basins of Northern and Central Kazakhstan

　　

有机废弃物作为肥料施用对于可持续农业具有重要意义，但前提是所引起的微生物群落变化不会破坏养分循环或土壤肥力。据研究人员所知，本研究首次采用PacBio 16S rRNA测序技术表征有机废弃物施用于土地后土壤微生物群的变化。该技术具有高分类分辨率，可改进对复杂土壤微生物群落的表征。为评估五种有机废弃物的微生物群，并描述田间施用后的土壤微生物群，研究人员在18个小区中，以模拟条施（band spreading）的等氮施用量，对每种废弃物设置3个重复。在施用后0、1、3、6和10周采集土壤芯样。施用前土壤中的主要属为Niallia（7.6%）和Unclassified_type_III（7.3%）。废弃物施用后，优势属包括：牛粪浆处理土壤中的UCG-001（13.3%）和DMER64（8.8%）；羊粪浆处理土壤中的Candidatus_Udaeobacter（8.5%）和unclassified_Xanthobacteraceae（7.9%）；猪粪浆处理土壤中的Niallia（6.1%）和Candidatus_Udaeobacter（5.8%）；家禽废弃物处理土壤中的Staphylococcus（27.3%）和Brachybacterium（26.7%）；以及厌氧消化污水处理污泥（anaerobically digested wastewater treatment sludge, DWWTS）处理土壤中的unclassified_Anaerolineaceae（25.8%）和Thiopseudomonas（14.2%）。土壤微生物群恢复至施用前状态所需时间为0至6周。有机废弃物类型强烈影响扰动的程度和持续时间，持续的变化可能影响微生物多样性、养分循环和土壤肥力。

**研究背景与意义**

土壤微生物群落在维持土壤肥力方面发挥关键作用，包括有机质与矿物质底物的转化、养分循环的调节以及生物修复过程的促进。有机废弃物作为肥料施用是常见的农业实践，能够改善土壤理化性质并提高微生物生物量和多样性。然而，不同来源的废弃物营养成分差异很大，其施用可能改变土壤pH和有机质含量，进而引起微生物群落结构变化，甚至有利于病原菌或耐逆类群增殖，破坏养分循环并最终降低土壤肥力。目前，关于粪肥施用对土壤微生物群的影响尚无共识，且以往研究多采用短读长测序技术如Illumina和Ion Torrent，其读长较短，可能导致基因组区域低估或分类归属不明确。PacBio循环共有测序（circular consensus sequencing, CCS）作为第三代测序技术，可对全长16S rRNA基因进行测序，分类准确率超过99.9%，更适合解析高度复杂的土壤微生物组。

**研究目的**

本研究的第一个目标是利用长读长测序表征砂质黏壤土，以及牛、羊、猪粪浆、家禽废弃物和厌氧消化污水处理污泥（DWWTS）中的微生物群；第二个目标是描述这些有机废弃物在田间条件下施用后10周内土壤微生物群的动态变化。

**研究方法概述**

田间试验于2025年8月至10月在爱尔兰韦克斯福德郡Johnstown Castle开展，共设置18个1 m²小区，每种废弃物设3个重复，以等氮速率模拟条施方式施用，另设3个对照小区。研究人员于施用前及施用后0、1、3、6、10周采集土壤柱状样品，提取DNA后进行PacBio全长16S rRNA基因测序（Revio平台，单分子实时测序）。利用DADA2（PacBio CCS优化版）进行去噪和扩增子序列变异（amplicon sequence variant, ASV）分析，QIIME2结合Silva数据库进行物种注释。计算Shannon指数和Berger-Parker指数评估α多样性，并基于Bray-Curtis和UniFrac距离进行主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度分析（NMDS）评估β多样性。

**研究结果**

**十周研究期间天气条件多变**：试验期间平均降水量为3.5 mm（0–31 mm），气温5.8–23.3 °C，土壤温度11.8–21.0 °C。

**有机废弃物初始ASV丰富度高，施用后显著下降**：共测序40个样本，平均每个样本获得1034个ASV。有机废弃物平均ASV数为2445，显著高于土壤对照中的668个。施用后，废弃物处理土壤的ASV数从2445降至10周后的746个。

**门水平动态显示废弃物驱动的短暂变化及向土壤微生物群的逐渐恢复**：未处理土壤以Pseudomonadota（22.3%）、Planctomycetota（21.8%）和Bacillota（19.2%）为优势门。不同废弃物施用后，相关门类（如牛粪浆中的Bacteroidota）立即增多，随后逐渐减少；至10周时，各处理土壤微生物组成大致恢复至施用前状态。

**属水平群落由低丰度类群主导，并出现短暂废弃物驱动变化与恢复**：施用前土壤中主要属包括Niallia（7.6%）和Unclassified_type_III（7.3%）。施用不同废弃物后，优势属因废弃物类型而异，例如家禽废弃物处理土壤中的Staphylococcus（27.3%）和Brachybacterium（26.7%），DWWTS处理土壤中的unclassified_Anaerolineaceae（25.8%）和Thiopseudomonas（14.2%）。多数废弃物相关属在数周内消失，土壤原有属逐渐重新占据优势。

**α多样性指数显示废弃物群落多样性降低、优势度增加，施用后逐渐恢复**：Shannon指数（Shannon Index, SI）显示，家禽废弃物（SI=4.06）和DWWTS（SI=4.03）的多样性最低；施用后土壤SI值最低分别持续至第6周和第3周，随后逐步恢复。Berger-Parker（BP）指数在所有废弃物中均高于土壤，施用后随时间下降，反映优势度逐渐减弱。

**β多样性动态显示废弃物与土壤群落明显分离，随时间趋于汇聚**：基于Bray-Curtis距离的PCoA显示，废弃物样品及施用后早期土壤样品与土壤对照明显分离，而后期样品与土壤对照聚集在一起。NMDS分析表明，废弃物群落拥有独特的分类单元，施用后这些独特类群逐渐消失，土壤微生物群落结构得以重建。

**讨论与结论**

讨论部分综合了不同废弃物对土壤微生物群落的差异性影响。牛粪浆和猪粪浆的影响仅持续约1周，羊粪浆几乎没有可检测的影响，而家禽废弃物和DWWTS的影响可持续3至10周。这种差异可能源于废弃物理化性质（如pH、干物质含量）的不同。此外，研究人员在羊粪浆中检测到较高丰度的Arcobacter属，在家禽废弃物中检测到Brachybacterium paraconglomeratum、Corynebacterium stationis和Staphylococcus arlettae等潜在病原菌，提示有机废弃物施用可能带来病原菌传播风险。

本研究结论为：据研究人员所知，本研究首次利用PacBio 16S rRNA测序表征有机废弃物施用后的土壤微生物群变化。结果表明，废弃物类型强烈影响土壤微生物群落的扰动幅度和持续时间；牛和猪粪浆相关类群在1周后消失，羊粪浆相关类群未被检测到，而DWWTS和家禽废弃物分别需要3周和10周才能恢复到接近施用前的状态。这些观察表明，某些有机废弃物可能对土壤细菌群落产生更持久的影响，长期变化可通过偏好病原菌或耐逆类群降低微生物多样性，并可能削弱养分循环和土壤肥力。