《Neurology International》：Ultrastructural Signatures of Amikacin Neurotoxicity and the Protective Modulation of Memantine in Peripheral Nerves: A Transmission Electron Microscopy Exploration in Wistar Rats
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背景/目的：氨基糖苷类抗生素如阿米卡星在治疗严重革兰阴性菌感染中不可或缺，但其临床使用受到充分记录的毒性特征的限制，这些研究几乎全部聚焦于耳毒性和肾毒性，而对其作用于外周神经系统的情况相对缺乏探索。美金刚，一种用于阿尔茨海默病的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA
背景/目的：氨基糖苷类抗生素如阿米卡星在治疗严重革兰阴性菌感染中不可或缺，但其临床使用受到充分记录的毒性特征的限制，这些研究几乎全部聚焦于耳毒性和肾毒性，而对其作用于外周神经系统的情况相对缺乏探索。美金刚，一种用于阿尔茨海默病的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂，已在外周神经动物模型中显示出保护作用，这引发了其能否限制阿米卡星潜在外周神经毒性的问题。方法：成年雄性Wistar大鼠被分配至三组：A组：对照组，不给予药物；B组：阿米卡星20 mg/kg/天腹腔注射，持续14天；C组：阿米卡星20 mg/kg/天联合美金刚10 mg/kg/天腹腔注射，持续14天。研究人员取臂丛神经分支和坐骨神经，制备并用于透射电子显微镜（TEM）检查，并以盲法评估轴突、髓鞘和施万细胞的超微结构。结果：A组显示完整轴突、致密髓鞘和正常施万细胞。B组显示显著的神经毒性损伤：髓鞘变性（分裂、扩张和折叠）、轴浆塌陷伴细胞器肿胀，以及形态异常的施万细胞。在C组中，美金刚显著减轻了神经纤维损伤：大多数轴突得以保留，髓鞘异常轻微且局灶性，并保留了大量正常施万细胞和无髓神经纤维。结论：阿米卡星对外周神经产生一种独特的、先前未被充分认识的超微结构神经毒性，同时给予美金刚可提供实质性神经保护，支持NMDA受体拮抗在氨基糖苷类抗生素治疗期间具有潜在的辅助作用。
论文解读文章
一、研究背景与问题
氨基糖苷类抗生素是治疗严重革兰阴性菌感染的重要杀菌药物，阿米卡星作为半合成卡那霉素衍生物，广泛应用于成人及儿童的多种感染，包括院内获得性肺炎、复杂性尿路感染、腹腔感染、皮肤软组织感染、脓毒症及菌血症，并用于耐药结核病等分枝杆菌疾病的联合治疗。然而，其临床使用受到明确毒性特征的限制，既往研究几乎完全集中于耳毒性和肾毒性，其中肾毒性源于药物在近端肾小管细胞内的蓄积，通常在停药后可逆；耳毒性则为耳蜗和前庭毛细胞的不可逆损伤，可能造成永久性损害。此外，氨基糖苷类还可引起神经肌肉接头阻滞。尽管阿米卡星在神经肌肉接头的作用已有较详细研究，但其对外周神经系统的作用却较少受到关注。已有研究偶然发现庆大霉素静脉及鞘内给药后可产生神经毒性，动物实验也表明氨基糖苷类可造成脊髓和外周神经损伤。然而，治疗剂量阿米卡星对外周神经的超微结构损伤特征及其潜在保护策略仍缺乏系统表征。透射电子显微镜（TEM）是评估外周神经精细形态的金标准方法，能够以纳米级分辨率直接显示轴突、髓鞘、施万细胞及细胞外基质，识别轴索损伤和脱髓鞘损伤的超微结构标志，包括髓鞘分裂、扩张和折叠、轴浆塌陷及细胞器肿胀、施万细胞改变等，而这些难以通过光镜观察。美金刚是N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂，用于治疗阿尔茨海默病，其作用机制不同于胆碱酯酶抑制剂，可阻断NMDA受体的病理性激活而保留生理性突触传递。既往研究显示美金刚在化疗诱导和缺血/再灌注诱导的外周神经损伤模型中具有神经保护作用，且NMDA受体拮抗可减轻氨基糖苷类相关的内耳耳毒性。因此，本研究旨在利用Wistar大鼠模型和透射电子显微镜，表征治疗剂量阿米卡星对臂丛神经和坐骨神经产生的超微结构变化，并探讨联合美金刚能否减轻这些变化，从而探究NMDA受体阻断在氨基糖苷类治疗中的辅助策略潜力。
二、研究设计与方法
研究人员采用实验性动物研究设计，选择Wistar大鼠模型，原因在于大鼠广泛用于药物神经毒性研究，易于操作，且其外周神经系统解剖和生理与人类足够相似，可进行转化推断。研究获得亚里士多德大学医学院主管机构和动物研究伦理委员会批准。实验使用成年雄性Wistar大鼠，体重300–500 g，分为三组：A组（对照组，不给药）、B组（阿米卡星20 mg/kg/天腹腔注射，连续14天）、C组（阿米卡星20 mg/kg/天联合美金刚10 mg/kg/天腹腔注射，连续14天）。每组7只，共21只，实验期间无动物死亡或剔除。剂量处于治疗范围内，相当于人类感染治疗剂量。样本量经先验功效分析确定，使用G*Power 3.1.9.6，采用F检验族、ANOVA（固定效应、总体系、单因素），效应量f=0.40，α=0.05，统计功效0.80，计算最少需要21只动物。实验结束后，在深麻醉下处死动物，双侧解剖臂丛神经分支和坐骨神经。组织处理包括：切成1 mm厚小块，3%戊二醛固定2小时，磷酸盐缓冲液漂洗10分钟，锇酸后固定1小时，再漂洗10分钟；双蒸水漂洗10分钟后，经梯度酒精（30%、50%、70%、96%、100%，最后一步重复6次）脱水；环氧丙烷浸透15分钟，Epon 812树脂包埋；超薄切片机切片，铜网捞片，醋酸铀和柠檬酸铅染色，透射电子显微镜观察。主要结局指标为三组间神经组织超微结构描述和形态学改变比较，以及阿米卡星单用组与阿米卡星+美金刚组之间损伤程度和模式的定性比较。评估以盲法进行，采用既定的轴索和脱髓鞘损伤超微结构标准。
三、研究结果
3.1 A组——对照组（健康大鼠）
对照组外周神经显示正常超微结构：有髓轴突的髓鞘致密、厚度均匀、结构均一；轴浆保存良好，含有规则排列的微管、微丝和线粒体；施万细胞完整，细胞核正常，包绕神经纤维；同时可见无髓纤维沿有髓纤维走行并与施万细胞相伴。
3.2 B组——阿米卡星组
阿米卡星诱导最显著的神经毒性改变，同时累及臂丛神经和坐骨神经。臂丛神经中，多条神经纤维出现病理性髓鞘，形态异质、轴浆皱缩、施万细胞改变。高倍镜下，坐骨神经中髓鞘分裂伴有轴浆塌陷及微管、微丝和线粒体显著肿胀；相邻纤维髓鞘变薄、轴浆肿胀。此外，变性髓鞘厚度不均并出现折叠区域，其下施万细胞胞质分裂。其他视野中可见髓鞘沿长节段扩张和分裂。总体而言，阿米卡星组显示出一致的髓鞘分裂、扩张和折叠，轴浆塌陷伴细胞器肿胀，以及施万细胞变性，符合混合性脱髓鞘和轴索损伤的超微结构特征。坐骨神经中髓鞘折叠损害了鞘的弹性，无髓纤维也轻度受累；臂丛神经中可见高度折叠和分裂的髓鞘与变性施万细胞并存，部分纤维一侧髓鞘分裂而对侧失去弹性并折叠。
3.3 C组——阿米卡星联合美金刚组
联合给予美金刚显著减轻了阿米卡星诱导的超微结构损伤。坐骨神经中可见正常和病理性髓鞘的神经纤维并存，轴浆正常；另一些视野中仅见轻微髓鞘变性和少数神经纤维轴浆皱缩，大量正常无髓纤维和施万细胞得以保留。较严重改变并未完全消失：臂丛神经中局部视野显示严重髓鞘变性伴扩张和分裂区域。然而，大多数坐骨神经轴突保持正常，仅个别纤维显示髓鞘变薄、弯曲或分裂，或局灶性髓鞘扩张伴轴浆肿胀。正常无髓纤维与偶尔轴突部分髓鞘分裂相邻。总体而言，超微结构损伤的范围、分布和严重程度显著低于阿米卡星单用组。
四、讨论与结论
本研究首次在体内对阿米卡星诱导的外周神经系统损伤及美金刚的调节作用进行了超微结构表征。研究人员发现，治疗剂量阿米卡星（20 mg/kg/天，14天）可在臂丛神经和坐骨神经产生可重复的髓鞘分裂、扩张和折叠，轴浆塌陷伴细胞器肿胀，以及施万细胞变性。联合美金刚（10 mg/kg/天）显著减轻了这些损伤的扩展范围、分布和严重程度，大多数纤维保留正常结构，仅残留局灶性轻微改变。研究人员认为，观察到的损伤模式与氨基糖苷类毒性机制一致：阿米卡星系多阳离子、膜通透性差的分子，可通过受体介导的内吞和非选择性阳离子途径缓慢进入真核细胞，蓄积于溶酶体并抑制磷脂酶，导致磷脂沉积症和溶酶体不稳定，这与肾毒性近端小管损伤相关；另一机制涉及线粒体，氨基糖苷类可干扰线粒体蛋白合成，损害氧化磷酸化并增加活性氧产生，被认为是耳毒性的核心通路。施万细胞兼具高能量需求和广泛膜系统，髓鞘形成细胞需要维持多层致密鞘并支持轴突代谢，其能量代谢和膜脂稳态的失败可解释髓鞘分裂、扩张和折叠，而线粒体损伤及ATP依赖性轴突运输障碍可解释线粒体肿胀、微管微丝紊乱及轴浆塌陷。美金刚的保护作用与NMDA受体拮抗在外周神经中的保护证据一致，既往研究显示NMDA受体抑制可保护坐骨神经缺血/再灌注损伤、改善挤压伤后功能恢复、减轻神经病理性疼痛模型中的机械性痛觉过敏并限制长春新碱诱导的外周神经病变。研究人员提出两种非排他性解释：一是受损轴突和施万细胞释放的谷氨酸或代谢衰竭后细胞内钙超载，可能招募轴突-施万细胞单元上的NMDA受体，将原发性代谢损伤转化为钙依赖性兴奋毒性损伤；美金刚作为非竞争性开放通道阻滞剂，具有快速解离动力学，可中断这一放大步骤而不影响生理传递。二是美金刚可能部分不依赖受体发挥作用，其作为小分子阳离子胺具有抗氧化和抗凋亡特性，可能减少线粒体活性氧产生或与阿米卡星竞争细胞摄取。研究局限性包括：超微结构评估为定性描述性，未进行髓鞘厚度、g-比值和轴突直径的定量形态计量；未包含神经传导研究、感觉运动测试等功能终点及施万细胞应激或脱髓鞘的分子标志物；仅测试单一阿米卡星剂量和疗程及单一美金刚剂量；仅研究成年雄性Wistar大鼠；从大鼠到人类外周神经的推断需谨慎。
结论：在该体内大鼠模型中，治疗剂量阿米卡星（20 mg/kg/天，14天）对外周神经系统产生独特的、先前未被充分认识的超微结构神经毒性，表现为臂丛神经和坐骨神经中髓鞘分裂、扩张和折叠，轴浆塌陷伴细胞器肿胀，以及施万细胞变性。联合给予NMDA受体拮抗剂美金刚（10 mg/kg/天）显著减轻了这些改变：大多数神经纤维保留正常结构，残余损伤轻微且局灶，这与临床评估中观察到的运动能力较好保存相平行。这些发现将髓鞘、轴浆和施万细胞确定为阿米卡星毒性的结构靶点，并表明NMDA受体阻断可限制该损伤，支持兴奋毒性信号作为可能的贡献机制。由于外周神经毒性在氨基糖苷类治疗期间不是常规监测项目，研究结果呼吁提高对该不良反应的临床认识，并在氨基糖苷类药物安全性研究中纳入外周神经终点。在美金刚的辅助神经保护作用进入临床考虑之前，应通过定量形态计量（髓鞘厚度、g-比值和轴突直径）、功能和电生理检测、剂量-反应及按性别分层设计，以及长期恢复评估来确认这些观察结果。
