利用高分辨率质谱实现协同的CID（碰撞诱导解离）和EAD（电子撞击解离）技术，快速发现并从头推断一种新肽的结构

《Analytica Chimica Acta》：Synergistic CID and EAD Fragmentation by High-Resolution Mass Spectrometry for Rapid Discovery and De Novo Structural Deduction of a New Peptide

　　

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  基于质谱（MS¹）的快速筛选方法用于发现新的代谢物候选物。
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  结合碰撞诱导解离（CID）和电子激活解离（EAD）碎片化技术，并通过知识指导进行优先级排序，以实现对新代谢物的高可信度结构鉴定。
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  利用核磁共振（NMR）和基因簇技术进一步完善结构细节。

引言

天然产物（NPs），也称为次级代谢物（SMs），是一类低分子量、结构多样且具有复杂生物活性的化合物，它们占据着独特的化学性质空间。[1] 然而，新天然产物的发现仍然主要依赖于传统的模式，即重复的提取和分离、耗时的核磁共振（NMR）结构鉴定以及非系统的峰值追踪。这种工作流程本质上耗时、成本高且效率低，共同阻碍了新天然产物发现的进度。[2], [3] 液相色谱-高分辨率质谱（LC-HR-MS）技术能够提供高通量的代谢物分析，从微量样品中分离出数百到数千种化合物，并且运行时间短，使其成为发现次级代谢物的不可或缺的技术。[4] 除了其分析能力外，MS¹模式还能提供前体离子信息，包括分子量和相对强度，而后续的MS²分析生成的诊断性碎片离子则有助于深入的结构表征和可靠的定性鉴定。

肽类是天然产物的重要组成部分。天然肽在生物体内通过核糖体或非核糖体肽合成酶（NRPS）途径合成。[5], [6], [7] 与其他类别的天然产物类似，肽的结构鉴定传统上依赖于NMR光谱学。然而，随着分子量从寡肽（约200-1000 Da）和多肽（约1000-5000 Da）逐渐增加到大肽（约5000-10000 Da），光谱复杂性显著增加，常常导致严重的信号重叠，这极大地阻碍了结构鉴定的准确性。[8], [9] 也有研究报道将LC-HR-MS应用于肽的结构解析。[10], [11], [12] 尽管传统的碰撞诱导解离（CID）[13], [14]可以生成分辨率较高的质谱图，但由于产物离子数量有限以及存在非典型氨基酸和多样的翻译后或生物合成修饰，其提供的结构信息往往不足以实现准确的结构鉴定。电子激活解离（EAD）[15]的出现通过提供更广泛的碎片离子谱，解决了这一限制。因此，CID和EAD以互补的方式共同工作，显著提高了结构推断的可靠性和深度。

尽管具有潜力，但CID和EAD的联合工作流程主要被应用于已知化合物类别中的异构体鉴别或修饰位点定位。[16], [17], [18], [19] 据我们所知，尚未有研究表明将CID和EAD碎片化技术与知识引导的优先级排序结合用于完全未知的微生物肽的从头结构解析。

在此背景下，我们对Streptomyces parvulus ZS18011菌株进行了无靶标代谢组学研究。基于MS¹数据，我们使用FUNEL [20]技术过滤掉无关信号，并将m/z 811.4716作为新型八肽的有希望的候选物。随后的CID和EAD碎片化分析使我们能够高度自信地从头推断出其完整的肽骨架。最终，NMR分析和基因组测序纠正了结构细节，证实了基于CID和EAD的结构鉴定的准确性。我们的方法加速了真正新天然产物的发现，证明了CID和EAD联合策略在结构推断中的优越性。它将发现范式从“未知到已知”转变为“半未知到已知”，即从盲目筛选转变为基于先验知识的定向优先选择。

章节片段

样品制备

Streptomyces parvulus ZS18011由浙江大学吴敏教授的实验室提供。种子培养物直接接种到含有200 mL MS液体培养基（w/v）的1000 mL埃伦迈尔烧瓶中，培养基成分包括豆粉（2%）、甘露醇（2%）、CaCO₃（0.3%），pH值为7.0。烧瓶在旋转振荡器上以180 rpm的速度培养7天。

发酵液和空白培养基对照液加入丙酮（9 mL:9 mL）中，进行30-60分钟的超声波处理。

MS¹数据分析有助于有效排除非目标化合物并优先选择新的肽候选物

基于LC-HR-MS的无靶标代谢组学分析通常每个样品会产生超过100,000个特征，其中大部分来自背景噪声或源内伪影等错误结果。[24] 因此，在化合物优先排序之前需要强大的数据预处理和计算过滤。重要的是，在天然产物研究中，MS¹信号强度具有特别的重要性，因为它经常反映提取特定代谢物的可能性，这是一个关键参数。

讨论

传统上，天然产物的结构鉴定主要依赖NMR光谱学，而高分辨率质谱（HR-MS）则用于后续验证。然而，基于NMR的结构鉴定需要纯化的化合物，而且分子量的增加常常导致NMR谱图中信号严重重叠，这大大阻碍了结构鉴定的准确性。在这项研究中，我们采用了一种反向分析流程，即在 crude 样品上进行基于HR-MS的结构推断。

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报道的工作。

Sunde Xu： 资金申请。 Yumei Cao： 可视化。 Yuhua Xian： 研究。 Junxiao Wang： 初稿撰写。 Chang Wang： 验证。 Fei Xu： 编写、审阅与编辑、监督。 Bin Wang： 监督。 Wenxia Fang： 形式分析。

所有数据均可在Zenodo上获取：[链接]

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  m/z
  811.4716的生物合成基因簇。
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  Streptomyces sp. ZS18011的全基因组序列。
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  Streptomyces sp. ZS18011的粗提取物的LC-MS/MS数据。
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  m/z
  811.4716的Marfey分析的原始LC-MS数据。
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  m/z
  811.4716的原始NMR数据。
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  ...
  的预测蛋白质序列。

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报道的工作。

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：32302427）、广西重点研发计划（编号：GuikeFN2600640608）以及微生物代谢国家重点实验室开放基金（编号：MMLKF26-22）的支持。

Junxiao Wang|Chang Wang|Yumei Cao|Yuhua Xian|Sunde Xu|Bin Wang|Wenxia Fang|Fei Xu