MuSK信号通过Crk/Crk-L介导的Rapgef1招募耦联乙酰胆碱受体在神经肌肉接头处的锚定

《Cell Chemical Biology》：Crk/Crk-L-mediated Rapgef1 recruitment couples MuSK signaling to AChR anchoring at the neuromuscular junction

　　

摘要专业翻译 神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）通过运动神经元与骨骼肌之间的双向信号传导得以建立，这一过程关键依赖于受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTK）MuSK。尽管Agrin、Lrp4和Dok-7对MuSK的激活机制已被充分表征，但下游信号传导的时间性组织仍不清楚。在本研究中，研究人员利用基于TurboID的邻近标记结合质谱技术（mass spectrometry, MS）定义了MuSK邻近蛋白质组。研究人员鉴定出74个MuSK相关蛋白，包括已知底物和此前未报道的相互作用因子。在早期信号组分中，接头蛋白Crk-L（CT10 regulator of kinase-like） emerged as a central hub linking MuSK to small GTPase pathways. 研究人员进一步鉴定出Rapgef1（Rap guanine nucleotide exchange factor 1）作为Crk-L相关的效应分子，为Agrin依赖性乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor, AChR）磷酸化和聚集所必需。成年肌肉中Rapgef1缺失导致NMJ碎裂。研究人员提出这些缺陷源于Rapsyn/AChR相互作用受损所导致的AChR细胞骨架锚定减少。上述发现揭示了Rapgef1作为MuSK介导信号传导的关键调控因子，并阐明了调控NMJ形成与维持的动态机制。

论文解读

一、研究背景与科学问题

神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）是运动神经元与骨骼肌纤维之间形成的特化突触结构，其功能完整性直接决定肌肉收缩能力。NMJ的破坏可导致肌无力和神经肌肉疾病。MuSK（muscle-specific kinase）是NMJ形成和维持的关键调控因子，属于受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTK）家族。在NMJ发育过程中，神经末梢释放的Agrin蛋白结合其共受体Lrp4（low-density lipoprotein receptor-related protein 4），形成包含两个MuSK和两个Lrp4分子的异源四聚体，进而诱导MuSK胞内结构域发生反式自磷酸化。MuSK在酪氨酸553位点（Y553）的自磷酸化招募胞质接头蛋白Dok-7（downstream of kinase-7），后者进一步促进MuSK二聚化和自身激活以及下游信号传导。Dok-7 C末端区域的两个酪氨酸残基在被MuSK磷酸化后，形成SH2结合位点，招募含有SH2和SH3结构域的接头蛋白Crk（CT10 regulator of kinase）和Crk-L（Crk-like）。Agrin、Lrp4、MuSK、Dok-7及Crk/Crk-L突变小鼠均因缺乏NMJ而在出生时死亡，表明这些分子在NMJ形成中不可或缺。

然而，尽管Agrin-Lrp4-MuSK-Dok-7的激活级联已被充分表征，MuSK下游信号传导的时间性组织仍不清楚。Agrin诱导的AChR聚集涉及细胞骨架重塑，但MuSK下游已鉴定的蛋白中，多数蛋白的确切作用尚未明确。特别是Crk/Crk-L下游的信号传导级联，尤其是其如何调控AChR聚集和锚定，仍缺乏系统认识。Rapsyn（receptor-associated protein at synapse）是连接AChR与细胞骨架并在NMJ处固定AChR所必需的蛋白，但MuSK信号如何调控Rapsyn-AChR相互作用进而影响受体锚定，此前尚不清楚。基于此，研究人员开展了本项研究，旨在系统绘制MuSK邻近蛋白质组并揭示其时间动态变化，从而阐明MuSK下游信号传导的分子机制。

二、研究内容与主要结论

研究人员利用TurboID邻近标记结合质谱技术，系统绘制了Agrin刺激下不同时间点的MuSK邻近蛋白质组，鉴定出74个MuSK相关蛋白。研究发现Crk-L作为早期信号中枢，将MuSK信号耦联至小GTPase信号通路。研究人员进一步鉴定出Rapgef1作为Crk-L的效应分子，在Agrin依赖性AChR磷酸化和聚集中发挥关键作用。肌肉纤维特异性敲除Rapgef1导致成年NMJ碎裂。机制研究表明，Rapgef1缺失导致AChR细胞骨架锚定减少和Rapsyn/AChR共定位降低。这些发现将Rapgef1确立为MuSK介导信号传导的关键调控因子，为理解NMJ形成与维持的动态机制提供了新视角，并提示Rapgef1可能作为保护或恢复NMJ完整性的潜在治疗靶点。

三、关键技术与方法

研究人员构建了稳定表达MuSK-TurboID融合蛋白的永生化小鼠成肌细胞系，经分化形成肌管后进行Agrin刺激，结合生物素孵育和链霉亲和素pull-down，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行蛋白质组学鉴定和定量分析。采用STRING数据库进行蛋白-蛋白相互作用网络分析，通过层次聚类和基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析解析蛋白的时间动态特征。运用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, coIP）验证蛋白间相互作用。采用siRNA敲低（knockdown, KD）技术研究Rapgef1在肌管中的功能。在体内实验中，研究人员利用Cas9mKI小鼠（肌肉特异性HSA-Cre表达并敲入Cas9，C57BL/6J背景）结合肌嗜性AAVMYO载体递送7个sgRNA，实现成年小鼠骨骼肌纤维特异性Rapgef1基因敲除（knockout, KO），并通过尾静脉注射进行系统性基因编辑。此外还运用了免疫荧光染色、共聚焦显微镜成像、aNMJ-morph形态计量分析、AChR可提取性实验、数字PCR（dPCR）等技术手段。

四、研究结果

MuSK-TurboID肌管细胞系的建立与功能验证

研究人员将TurboID融合至MuSK的C末端，通过逆转录病毒转导永生化小鼠成肌细胞，筛选获得稳定表达MuSK-TurboID的细胞系。该细胞系中MuSK-TurboID表达量约为内源MuSK的2倍，但肌管形成正常，AChR聚集的数量和面积与野生型无显著差异，且MuSK-TurboID与内源MuSK及AChR聚集共定位。Agrin刺激下，内源MuSK和MuSK-TurboID均在15-30分钟达到最大磷酸化，激活动力学一致。TurboID活性在生物素补充15分钟后即可检测，并随时间递增至360分钟。这些结果表明MuSK-TurboID肌管细胞在生物学上与亲本细胞系不可区分，适用于研究Agrin依赖性MuSK相互作用组。

MuSK邻近标记揭示Agrin诱导信号网络的时间动态变化

研究人员对MuSK-TurboID肌管分别进行2小时、4小时和8小时的Agrin刺激（生物素在最后2小时加入），以未刺激细胞作为阴性对照，每组三次重复。经链霉亲和素pull-down和LC-MS/MS分析，共定量到4,717个生物素化蛋白，其中74个在Agrin刺激后显著富集（log?FC ≥ 1，校正后p值 < 0.05）。其中18.9%为已知MuSK相互作用因子，包括Lrp4、Dok-7、Crk/Crk-L和Rapsyn，其余81%为此前未报道的新相互作用因子。三个时间点分别鉴定出36、23和50个蛋白，其中4小时时间点的所有蛋白均与2小时或8小时重叠，无独有蛋白。STRING网络分析显示，2小时时间点富集了Dok-7、Crk蛋白及多个此前未识别的相互作用因子；8小时时间点则富集了Rapsyn及参与AChR聚集后期阶段的蛋白。

Crk-L效应分子的时间动态及其对小GTPase活性的调控

层次聚类分析将74个候选蛋白分为四个簇：簇1为早期邻近MuSK但随后逐渐减少的蛋白；簇2为2小时和4小时存在、8小时丰度最高的蛋白；簇3为所有时间点稳定结合的蛋白；簇4为富集程度随时间递增、8小时达到峰值的蛋白。GO分析显示，簇1蛋白富集于小GTPase介导的信号转导相关功能。研究人员从簇1中筛选出9个候选蛋白，STRING分析表明这些蛋白是Crk/Crk-L的下游效应分子，包括Dock蛋白（downstream of Crk，与ELMO形成复合物作为鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor, GEF）特异性激活Rac1）、Sos1/Sos2（主要激活Ras蛋白）、Rapgef1（作为小GTPase Rap1的GEF）以及ASAP1（作为Arf的GTPase激活蛋白（GTPase-activating protein, GAP））。这些发现表明Crk蛋白在Agrin-MuSK通路早期作为信号中枢，协调多种小GTPase（如Rac1、Ras和Rap1）的招募和激活。

Rapgef1定位于NMJ并通过Crk-L被招募至MuSK相互作用组

免疫共沉淀实验证实Rapgef1与Crk-L存在强相互作用，且该相互作用不依赖于Agrin刺激时长，为组成性结合。相比之下，Dok-7与Crk-L或Rapgef1的相互作用依赖于Agrin刺激，且最强相互作用出现在刺激后1-2小时，与Dok-7磷酸化动力学一致。共沉淀实验排除了Rapgef1和Asap1作为MuSK直接相互作用因子的可能性，仅Dok-7和Crk-L能与MuSK共沉淀。免疫荧光染色显示，在成年小鼠的胫骨前肌（tibialis anterior, TA）、趾长伸肌（extensor digitorum longus, EDL）和比目鱼肌（soleus, SOL）中，Rapgef1均定位于NMJ，与MuSK和AChR共定位，100%的NMJ为Rapgef1阳性，77%-79%的AChR区域与Rapgef1信号重叠。坐骨神经横断后Rapgef1表达逐渐增加，提示其在NMJ功能中发挥作用。研究人员据此提出假说：Crk-L与Rapgef1的预组装复合物在Dok-7磷酸化后被招募至Dok-7，从而促进Rapgef1在突触后膜的定位。

Rapgef1调控肌管中Agrin-MuSK信号传导和AChR聚集

研究人员利用siRNA在完全分化的肌管中敲低Rapgef1，敲低效率约70%，且不影响MuSK和AChR等其他突触蛋白的表达水平。Rapgef1敲低对Agrin诱导的MuSK磷酸化无显著影响，但导致AChR β亚基酪氨酸磷酸化水平降低41%。在AChR聚集实验中，对照肌管经Agrin过夜处理后形成全尺寸AChR聚集（面积 > 8 μm2），而Rapgef1敲低肌管中微聚集（面积 < 5 μm2）占主导，全尺寸聚集显著减少。这些结果表明Rapgef1在MuSK下游信号传导中发挥作用，其缺失严重影响Agrin诱导的AChR磷酸化和聚集。

肌肉纤维特异性Rapgef1敲除导致NMJ碎裂

研究人员利用Cas9mKI小鼠结合AAVMYO载体递送7个靶向Rapgef1共享外显子的sgRNA，实现成年骨骼肌纤维特异性Rapgef1基因敲除。肌肉内注射3周后，靶向肌肉中Rapgef1 mRNA表达降低约80%，H&E染色未发现明显组织学异常。系统性尾静脉注射后7周，Rapgef1 KO小鼠与对照在体重、握力、倒挂测试和肌肉质量方面均无显著差异。分子分析确认Rapgef1转录水平降低约50%、蛋白水平降低约70%，且NMJ处Rapgef1信号消失。EDL肌肉整体mount染色显示，对照NMJ呈椒盐卷饼样结构，而Rapgef1 KO小鼠的NMJ呈现显著碎裂。形态计量分析显示Rapgef1 KO小鼠AChR片段数量显著增加：47.4%的NMJ显示超过5个AChR片段，10.6%显示超过10个聚集，而对照分别为10.7%和0%。尽管Rapgef1 KO未导致严重的神经肌肉功能缺陷，但NMJ碎裂表型支持Rapgef1在AChR聚集和突触后装置维持中的作用。

Rapgef1调控肌动蛋白细胞骨架重排和突触后位点AChR稳定

Agrin处理的Rapgef1敲低肌管中，AChR聚集显著变小，同时肌动蛋白缆状结构被破坏，类似于细胞松弛素D处理后的表型。AChR可提取性实验显示，Agrin刺激降低了对照细胞中AChR的提取率，更多受体在第二和第三次提取中被溶解，表明受体与细胞骨架的锚定增强；而Rapgef1敲低肌管中未观察到这一模式，第一次提取中回收的AChR水平与是否Agrin处理无关，表明受体锚定受损。Rapsyn共定位分析显示，Agrin处理的Rapgef1敲低肌管中AChR与Rapsyn的共定位面积和共定位聚集大小均显著低于对照。这些结果表明Rapgef1通过调控AChR-Rapsyn复合物与细胞骨架的相互作用，参与Agrin依赖性AChR聚集的形成。

五、讨论与结论

本研究的讨论部分首先总结了TurboID邻近标记策略的优势：鉴定出74个富集的MuSK相互作用因子，其中81%为此前未报道的新因子，验证了该方法的灵敏度和特异性。三个时间点共享10个蛋白，包括Lrp4；此外还鉴定出Lrpap1（低密度脂蛋白受体相关蛋白相关蛋白1），提示其可能协助Lrp4的折叠和运输。8小时时间点富集的蛋白包括肌营养不良蛋白相关蛋白复合物（dystrophin-associated protein complex, DGC）成员（如α-dystrobrevin和β-1-syntrophin）以及Coronin 6、Rapsyn和Utrophin等介导AChR锚定和聚集稳定的蛋白。Agrin本身在8小时时间点显著富集，且C末端肽段随时间增加，提示其可能随Lrp4和MuSK共同内化。研究人员还讨论了Crk蛋白作为信号中枢的机制：其SH2结构域以可调控的开关机制结合磷酸酪氨酸蛋白（输入通路），而SH3结构域介导的相互作用是组成性的（输出通路），使Crk能够招募组成性结合的调控因子进入信号体，从而多样化下游信号通路。关于Rapgef1的作用机制，研究人员提出两种可能：一是Rapgef1通过其催化活性调控小GTPase参与AChR聚集；二是Rapgef1作为支架蛋白招募或调控非受体酪氨酸激酶（non-receptor tyrosine kinases, NRTKs），如Src家族激酶（Src family kinases, SFKs）和Abl家族激酶，这些激酶负责AChR的磷酸化。由于Rapgef1缺失导致Rapsyn/AChR共定位降低和AChR磷酸化减少，研究人员提出Rapgef1可能通过以下机制发挥作用：MuSK激活后，Rapgef1/Crk-L复合物通过与Dok-7的相互作用定位至质膜，一方面促进突触后细胞骨架组织，另一方面作为支架蛋白招募或调控AChR磷酸化和Rapsyn相互作用所需的NRTKs，从而确保AChR的正确定位。

研究结论部分指出：本研究系统表征了Agrin刺激下MuSK相互作用组的时间动态变化，揭示了Crk-L作为信号中枢在早期阶段招募小GTPase相关因子的作用，鉴定出Rapgef1作为通过Crk-L经Dok-7被招募至MuSK相互作用组的关键下游调控因子。肌管中Rapgef1敲低和骨骼肌纤维中Rapgef1缺失分别导致AChR聚集受损和NMJ不稳定，其机制可能为Rapsyn/AChR相互作用受损导致的AChR细胞骨架锚定减少。这些发现将Rapgef1确立为MuSK介导信号传导的关键调控因子，增进了对NMJ形成和维持复杂机制的理解，并提示Rapgef1可能作为保护或恢复NMJ完整性的潜在靶点。