# 新烟碱类杀虫剂及其代谢物的液相色谱-电喷雾电离-串联质谱分析方法开发与多基质验证研究

《Toxicology Mechanisms and Methods》：Analysis of Neonicotinoid Pesticides and their Metabolites by Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry

　　

新烟碱类杀虫剂于1990年代首次引入，作为有机磷酸酯类、氨基甲酸酯类和氯化烃类等更古老、毒性更强的杀虫剂的替代品，此后已成为全球使用最广泛的杀虫剂类别。然而，由于其对该类杀虫剂对传粉昆虫（如蜜蜂）、有益捕食性昆虫乃至食虫鸟类具有高毒性，其使用亦伴随着重大代价。为深入研究新烟碱类杀虫剂的影响，研究人员开发了一种采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）分析吡虫啉、噻虫胺和烯啶虫胺的方法。通过标准品优化了串联四极杆质谱（MS/MS）检测中特定多反应监测（MRM）碎裂通道的参数，并采用超高效液相色谱（UPLC）实现色谱分离。然而，经酶联免疫吸附测定（ELISA）检测呈新烟碱类阳性的哺乳动物样本，通过LC-ESI-MS/MS法却未检出任何母体化合物。应研究人员要求，将新烟碱类代谢物——6-羟基烟酸、2-氯-1,3-噻唑-5-甲酸、2-咪唑烷酮、6-氯烟酸、吡虫啉脲、吡虫啉烯烃、脱硝基吡虫啉和5-羟基吡虫啉纳入方法。该方法在线性响应、检出限/定量限、保留时间稳定性、仪器残留、日内及日间精密度、标准曲线稳定性、准确度和特异性方面均进行了验证。大多数化合物的定量限测得为0.1 ppb，但脱硝基吡虫啉和5-羟基吡虫啉的定量限高于1 ppb。该方法作为初步研究应用于提取的农产品样品以测试其实用性。红葡萄中含有吡虫啉，而腌黄瓜中含有吡虫啉和噻虫胺。令研究蜜蜂蜂群崩溃的研究人员担忧的是，四个蜂蜜样品中有两个样品的吡虫啉代谢物6-羟基烟酸含量高于5 ppb。

# 新烟碱类杀虫剂及其代谢物的液相色谱-电喷雾电离-串联质谱分析法：方法开发、系统验证及实际样品应用

## 一、研究背景

新烟碱类杀虫剂于1990年代首次引入，此后迅速成为全球使用最广泛的杀虫剂类别，约占世界杀虫剂市场总量的四分之一。该类化合物源于对天然杀虫剂烟碱的深入研究——烟碱作为烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）激动剂，在昆虫中枢神经系统中介导大多数兴奋性神经传递。新烟碱类化合物通过模拟乙酰胆碱作用，不可逆地结合并激活昆虫nAChR，导致昆虫过度兴奋、麻痹乃至死亡。

与早期杀虫剂相比，新烟碱类化合物具有优良的内吸传导能力、改善的光稳定性和显著的杀虫活性。然而，其广泛使用也带来了严重的生态代价——对蜜蜂等传粉昆虫、有益捕食性昆虫乃至食虫鸟类具有高毒性。新烟碱类农药在环境中的广泛存在与蜜蜂蜂群崩溃失调（Colony Collapse Disorder）之间存在密切关联，蜂群死亡率在某些研究中可高达92%，这对全球依赖授粉作物的农业生产和粮食安全构成严重威胁。

其快速代谢和环境降解特性导致一个重要的分析难题：在各类基质中，母体化合物往往已迅速转化为多种代谢产物。这种复杂性使得仅检测母体化合物的传统方法无法满足环境监测和食品安全监管需求。与此同时，多个国家对新烟碱类化合物在水果、蔬菜、谷物等食品中最大残留限量的监管日益严格，对高灵敏度、高特异性的多残留检测方法的需求愈发迫切。

## 二、研究目的与意义

基于上述背景，本研究旨在开发并全面验证一种基于液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）的分析方法，实现对吡虫啉（imidacloprid）、噻虫胺（clothianidin）和烯啶虫胺（nitenpyram）三种新烟碱类母体化合物及其八种主要代谢产物进行同步灵敏检测。

该方法开发和验证工作的直接驱动因素源于明尼苏达州自然资源部的一个实际检测困境：该机构长期采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法筛查白尾鹿脾脏中的新烟碱类暴露，但原始LC-ESI-MS/MS方法无法检出ELISA阳性样本中的任何母体化合物。这一矛盾促使研究人员将方法扩展至代谢物检测范畴。方法全面验证后，明尼苏达州自然资源部成功检测了800份猎人提交的鹿脾脏样品，其中61%检出新烟碱类暴露，揭示了即使林区也存在显著的环境污染。

## 三、技术方法概述

本研究在密歇根州立大学兽医学诊断实验室（MSU VDL）开展。化学标准品（吡虫啉、6-羟基烟酸、2-氯-1,3-噻唑-5-甲酸、2-咪唑烷酮、6-氯烟酸、噻虫胺、吡虫啉脲、吡虫啉烯烃和烯啶虫胺）购自Sigma-Aldrich，农产品样品（青葡萄、红葡萄、蓝莓、黄瓜和蜂蜜）采集自密歇根州中部农贸市场。采用AB Sciex 6500+电喷雾电离-串联质谱仪（ESI-MS/MS）联用Shimadzu超高效液相色谱系统（UPLC），色谱柱为Kinetex F5（2.6 μm，100×3 mm）。通过直接进样对每个化合物的母离子-子离子对进行多反应监测（MRM）参数优化。以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱。样品用含内标（咪达唑仑-d4）的乙腈均质提取后离心过滤。方法学验证涵盖线性、检出限/定量限（LOD/LOQ）、保留时间稳定性、仪器残留、日内/日间精密度、标准曲线稳定性、准确度和特异性等参数。

## 四、研究结果

### 4.1 多反应监测(MRM)质量对选择

通过质谱全扫描确认各化合物的母离子后，优化了每个化合物的MRM质量对参数，并与文献报道值进行比对验证。所有化合物均以正离子模式[M+H]⁺检测，各化合物的去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）等参数均在补充材料中汇总。

### 4.2 方法验证：线性

所有化合物均呈现良好分离的色谱峰，可与背景噪声清晰区分。各化合物标准曲线的决定系数R²均大于0.9950，总平均值为0.99762 ± 0.00131，证明方法在测定浓度范围内具有良好的线性响应。

### 4.3 方法验证：内标

内标在标准曲线构建中起关键作用，可校正相邻标准品或样品之间的提取或仪器性能差异。通过比较内标在肝脏基质中与纯标准品中的平均响应，计算得到内标回收率约为85%，表明基质效应较弱。在后续发展中，内标组成已扩展至包含噻虫胺-d3、噻虫嗪-d3、啶虫脒-d3、噻虫啉-d4和吡虫啉-d4。

### 4.4 方法验证：回收率

通过比较纯溶剂标准曲线与肝脏基质标准曲线斜率，测得5-羟基吡虫啉、吡虫啉和吡虫啉烯烃的回收率分别为86%、90%和89%。然而，6-羟基烟酸的基质标准曲线明显受抑，回收率仅7%，说明必须辅以内标校正或基质匹配标准曲线才能获得准确定量结果。

### 4.5 方法验证：检出限与定量限

以空白运行中峰响应的标准偏差乘以3.3倍和10倍分别计算检出限（LOD）和定量限（LOQ）。大多数化合物的LOQ约为0.1 ppb（ng/mL），但2-咪唑烷酮、脱硝基吡虫啉和5-羟基吡虫啉的LOQ超过1 ppb。仪器残留分析显示各化合物残留率极低，范围为0.0%-0.09%。

### 4.6 方法验证：分析精密度

日内精密度以每个化合物标准曲线回算值的相对标准偏差（%RSD）来评估，日间精密度为三个非连续日测定的平均值。大多数化合物在适用浓度范围内的%RSD低于10%。低浓度端（0.05-0.25 ppb）的变异性增大符合霍维茨效应（Horwitz Horn effect）。各化合物的可靠定量下限确定为：吡虫啉0.1 ppb，噻虫胺0.05 ppb，烯啶虫胺0.5 ppb，6-羟基烟酸0.25 ppb，6-氯烟酸0.05 ppb，2-咪唑烷酮1 ppb等。

### 4.7 方法验证：准确度

准确度评估显示，Sciex软件（线性拟合）在高浓度标准品（25和50 ppb）的回算值普遍偏高，而Excel采用多项式拟合后对高浓度端回算准确度改善明显，但在低浓度端（0.5 ppb以下）偏差增大。两种拟合方式各有优劣，建议实际操作中采用非线性（多项式）校准曲线并辅以低浓度端加权（1/x加权）以获得最佳准确度。

### 4.8 方法验证：特异性

通过保留时间、母离子质量数和定性/定量离子对（qualifier/quantifier）面积比等多维度考察，确认各化合物之间可良好区分。虽然6-羟基烟酸（0.990 min）和2-咪唑烷酮（0.956 min）以及6-氯烟酸（2.426 min）和吡虫啉脲（2.384 min）的保留时间较为接近，但其母离子m/z值差异显著，因此不存在相互干扰。从19种候选干扰物中筛查发现，仅2-氯烟酰胺可能需要作为潜在干扰物考虑。

### 4.9 样品检测结果

将已验证的方法应用于实际样品检测，取得了具有一定公共卫生意义的发现。2023年夏季采集自密歇根州农贸市场的蓝莓、红葡萄和青葡萄中，仅红葡萄检出吡虫啉（16.45 ng/mL）。对泡菜和红葡萄的研究显示，吡虫啉存在于所有样品中，泡菜中还额外检出噻虫胺。用清水冲洗红葡萄可将吡虫啉含量降至初始量的约6%；冲洗泡菜可将噻虫胺降至初始量的21%、吡虫啉降至12%。去皮泡菜中两种杀虫剂含量更低。

最值得关注的是蜂蜜样品的检测结果——四个蜂蜜样品中有两个检出了吡虫啉的代谢物6-羟基烟酸，且含量高于5 ppb。这一发现表明，至少部分养蜂场的蜜蜂曾暴露于吡虫啉。该结果呼应了已有文献报道：亚致死浓度的吡虫啉可通过影响蜜蜂采蜜和攀爬能力造成慢性毒性，并可通过下调肌肉相关基因表达影响蜜蜂生存能力。此外，土壤中残留的吡虫啉会显著降低野生蜂的筑巢活动。

## 五、讨论与结论

本研究所开发的LC-ESI-MS/MS方法在多种验证参数上均表现良好：对大多数化合物可实现0.1 ppb级的灵敏定量，线性、精密度、准确度和特异性均达到分析要求。该方法已成功应用于解释哺乳动物ELISA检测中母体化合物无法检出的困惑，并在实际农产品中检测到吡虫啉和噻虫胺。尤其值得关注的是，在蜂蜜中检出吡虫啉代谢物6-羟基烟酸的结果，为蜜蜂健康和安全提供了重要的警示信号——新烟碱类农药的环境残留不仅对传粉昆虫构成直接威胁，还可能通过食物链对生态系统和人类健康产生深远影响。该方法的建立和验证为环境监测、食品安全监管以及新烟碱类农药的毒理学研究提供了可靠的技术支撑。