劫持死亡肿瘤细胞用于肺部靶向基因增强铜死亡疗法

《Biomaterials》：Hijacking dead tumor cells for lung-targeted and gene-augmented cuproptosis therapy

　　

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  仿生肺部靶向与免疫屏蔽：DACu 内部封装了 AAV-ATP7A^KO 载体，同时通过"点击"化学将负载 CuET 的白蛋白纳米颗粒锚定在其表面。该设计利用物理毛细血管滞留和生物同型黏附作用，实现了肺部病毒蓄积增加约 120 倍，同时其胞内腔室充当免疫豁免屏障，使 AAV 能够逃逸中和抗体的作用。
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  肿瘤特异性外排阻断—内流放大策略：在肿瘤微环境中结构解体时，DACu 系统触发由COX2 启动子驱动的肿瘤特异性 ATP7A 敲除。这种精确的基因敲除结合 CuET 介导的铜超载，迫使细胞内铜应激超过致死阈值，从而有效抑制代谢耐药通路。
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  内源性疫苗效应：与铜死亡引起的强烈细胞应激协同作用，DCH 上保留的肿瘤相关抗原库作为原位疫苗发挥作用。这种双重作用方法可引发强烈的全身性 T 细胞免疫应答，从而清除原位肺癌和侵袭性黑色素瘤肺转移灶。

引言

肺部恶性肿瘤，包括原发性肺癌和各种转移性肿瘤，是全球范围内最普遍且致死性最强的疾病之一。^[1] 其惊人的死亡率不仅归因于早期诊断的挑战，还源于肿瘤细胞在复杂的肺部微环境中表现出侵袭性生长以及对基于传统细胞凋亡疗法的的多药耐药性（MDR）。^[2] 近年来，铜死亡——一种新型铜依赖性程序性细胞死亡，其特征为脂酰化蛋白聚集和铁硫簇蛋白丢失^[3]——作为一种突破性策略出现，可绕过经典的凋亡逃逸通路。^[4] 双硫仑作为一种经 FDA 批准并重新用于肿瘤学的药物，可在原位形成铜二乙基二硫代氨基甲酸酯（CuET）以触发铜死亡。^[5-7] 然而，其临床转化受到两个关键瓶颈的严重阻碍：首先，难以在弥漫性肺部病灶中实现溶解性差的小分子药物高蓄积；^[8] 其次，铜外排转运蛋白 ATP7A 的代偿性上调维持了细胞内铜稳态，阻碍了致死性铜蓄积，^[9,10] 从而构建了强大的代谢耐药屏障。因此，实现精确的肺肿瘤靶向并协同阻断 ATP7A 介导的外排以强制破坏铜稳态，对于释放铜死亡临床潜力至关重要。

尽管 CRISPR/Cas9 技术为 ATP7A 敲除提供了精确工具，但其理想载体——腺相关病毒（AAV）——的系统性应用却受困于宿主中和抗体的快速清除以及次优的肺部靶向能力。^[11,12] 受细胞物理滞留和癌细胞自主归巢等自然现象启发，^[13-16] 我们开发了一种基于灭活肿瘤细胞的"死细胞搭便车"（DCH）共递送平台，为 AAV 与化疗药物的联合递送提供了系统性解决方案。利用其独特的生物物理特性，DCH 递送平台建立了以被动滞留和主动锚定为特征的双重肺肿瘤靶向机制。具体而言，DCH 的微米级尺寸便于在静脉注射后于肺微循环中实现高效的毛细血管滞留。随后，通过利用保留的表面黏附分子（包括 CD44）^[16]，该平台通过固有的同型黏附作用实现主动归巢，并精确定位于原发病灶和转移结节。在货物装载和协同治疗方面，DCH 平台具有独特优势。对于病毒递送，其胞内腔室为 AAV 提供了天然的免疫遮蔽屏障，使其能够逃逸中和抗体并以"特洛伊木马"方式实现高效感染。对于药物递送，溶解性差的 CuET 预先封装入生物相容性高的白蛋白纳米颗粒（CuET@HSA NPs），并通过丰富的化学活性位点共价锚定至 DCH 表面。这种细胞—纳米颗粒杂化架构不仅克服了溶解性差的小分子药物装载难题，还充分发挥了细胞载体在复杂生物环境中的导航作用。此外，DCH 上保留的全细胞肿瘤抗原库可诱导出原位疫苗效应，^[17-19] 协同刺激强烈的抗肿瘤免疫应答，为肺部恶性肿瘤的系统性综合治疗奠定了基础。

基于这一理性设计，我们构建了 DACu 协同治疗系统，以 DCH 为靶向核心，整合 ATP7A 敲除（ATP7A^KO）与铜死亡诱导（图 1）。该系统利用 DCH 的双重肺肿瘤靶向能力，实现 AAV 与 CuET@HSA NPs 向肺部病灶的精确共递送。抵达靶点后，DACu 系统在肿瘤微环境中过表达的蛋白酶与细胞凋亡体吞噬的协同驱动下发生结构解体。^[20-23] 这一过程触发 AAV 的释放和核转位以实现转导，同时诱导白蛋白纳米基质降解以原位释放 CuET。通过采用肿瘤特异性启动子（COX2 启动子）驱动 CRISPR/Cas9 表达，^[24,25] 该系统实现了仅在肿瘤细胞中特异性沉默 ATP7A。结合 CuET 的作用，实施了一种外排阻断—内流放大的代谢调控策略，强制将细胞内铜应激推过致死阈值。此外，铜死亡引起的强烈细胞应激与 DCH 提供的全面抗原谱协同作用，充当原位疫苗，激活强烈的全身性抗肿瘤免疫应答。通过将精确的双重肺靶向与多维机制协同相结合，本研究为克服原发性和转移性肺部恶性肿瘤的耐药挑战提供了系统性的生物医学范式。

章节摘要

DACu 系统的构建与表征

DACu 系统的模块化组装策略如图 1A 所示，包含三个层级步骤：内部封装腺相关病毒（AAV-ATP7A^KO）、细胞表面代谢叠氮修饰，以及通过生物正交点击化学共价锚定载药纳米颗粒（CuET@HSA NPs），随后进行液氮冻融灭活。我们首先对单个纳米和病毒组分进行了表征。透射电子显微镜（TEM）显示

讨论

铜死亡作为一种新阐明的程序性细胞死亡通路，为克服传统肿瘤耐药提供了变革性机遇。^[3,30] 然而，其临床转化受到代偿性耐药的严重阻碍，主要源于铜外排泵（如 ATP7A）的上调^[10,31]，以及铜死亡诱导剂生物利用度低和靶向性差的问题。^[8] 为打破这一治疗僵局，本研究开创性地开发了一种仿生递送平台

结论

总之，本研究建立了 DACu 系统作为针对肺部恶性肿瘤基因增强铜死亡治疗的变革性仿生平台。通过将"死细胞搭便车"策略固有的肺归巢能力与 CRISPR 介导的代谢重编程相结合，我们开发了一种多维策略，有效克服了 CuET 生物利用度低和代偿性耐药的关键瓶颈。该范式的核心在于外排

材料与方法

研究设计。本研究旨在探究一种基于"死细胞搭便车"（DCH）的共递送系统的协同抗肿瘤功效及其潜在机制，该系统整合了 AAV 介导的 ATP7A 基因组消融与 CuET 诱导的铜死亡。DACu 系统通过将 AAV-ATP7A^KO（AAV6 血清型，由 COX2 启动子驱动）和 CuET@HSA 纳米颗粒（NPs）共同装载入灭活肿瘤细胞构建而成。对其形态、病毒封装和药物载药量进行了表征

CRediT 作者贡献声明

王雨欣：方法学。杨晓佳：方法学。孙勋：验证、项目管理、资金获取、概念化。张永顺：撰写—审阅与编辑、验证、监督、项目管理、方法学、调查、概念化。王海瑞：方法学。杨兰：方法学

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

数据可用性声明

评估论文结论所需的所有数据均在论文和/或支持信息中呈现。源数据可根据合理请求向通讯作者索取。

利益冲突声明

作者声明不存在已知的相互竞争的经济利益或个人关系可能对本研究报告的工作产生影响。

致谢

本工作得到以下项目的资助：国家重点研发计划（2023YFC2307700）；国家自然科学基金委员会（U24A20811 和 824B2112）；111 项目（批准号 B18035）；中国农业科技创新体系四川省兽医兽药创新团队（SCCXTD-2025-18）。

张永顺|杨兰|王海瑞|杨晓佳|王雨欣|孙勋