基于RNA或病毒样颗粒递送的TwinPE技术精准删除弗里德赖希共济失调FXN基因中GAA重复序列

《Cell Insight》：TwinPE delivered as RNA or VLP enables precise deletion of GAA repeats in the FXN gene

　　

摘要专业翻译 TwinPE以RNA或VLP形式递送可实现FXN基因中GAA重复序列的精准删除 •TwinPE以高保真度精准删除FXN基因中的致病性GAA重复序列 •TwinPE在FRDA成纤维细胞和患者来源的iPSCs中实现高效编辑（13.3%–40.6%） •TwinPE在FRDA成纤维细胞和iPSCs中实现95%–98.2%的精准编辑比例 •TwinPE使患者来源的iPSCs中FXN mRNA表达恢复约两倍 •VLP可实现将TwinPE递送至有丝分裂后iPSC来源的运动神经元 弗里德赖希共济失调（FRDA或FA）是一种罕见的常染色体隐性神经退行性疾病，属于重复扩增疾病（REDs）这一遗传病类别，其中超过临界阈值的重复序列可导致发育性、神经性或神经肌肉性疾病。FRDA由frataxin（FXN）基因第一个内含子中鸟嘌呤-腺嘌呤-腺嘌呤（GAA）三核苷酸重复序列的扩增引起：健康个体携带5–30个GAA重复，而FRDA患者携带55至超过1700个重复。在分子水平上，长GAA重复序列可形成RNA/DNA杂交体（R-loops），损害RNA聚合酶II的延伸，导致转录沉默和FXN蛋白水平降低。由此产生的FXN缺陷损害线粒体铁代谢，干扰铁硫簇的合成并导致氧化应激。病理变化在背根神经节、脊髓、脑干和小脑中最为显著。临床体征包括步态共济失调、肌无力、感觉丧失、脊柱侧凸、复杂眼球运动障碍、视力丧失、听力损伤和肥厚型心肌病。在晚期阶段，严重的运动功能障碍导致独立行走能力丧失，大多数患者需要永久使用轮椅。此外，严重的心肌病或心律失常可导致过早死亡，许多患者无法存活超过40岁。 目前的治疗策略，包括激活核因子红细胞2相关因子2（NRF2）以保护细胞免受氧化应激的Omaveloxolone，以及基于AAV的基因治疗LX2006（通过外源构建体增加FXN蛋白水平），要么缺乏特异性，要么存在FXN过表达的风险，后者可导致心脏毒性和肝毒性。基于寡核苷酸的基因激活方法虽然显示出前景，但尚未被证明具有足够的效力和特异性用于治疗。因此，迫切需要能够删除GAA重复扩增并从而直接在FXN基因内源调控环境中靶向其根本遗传病因的治疗策略。 此前研究已报道使用Cas9核酸酶或碱基编辑器删除或中断GAA重复序列。例如，Cherqui等人报道，在FRDA患者iPSCs中通过Cas9介导的重复序列删除可预防iPSC来源神经元中与FRDA相关的线粒体表型。然而，许多Cas9方法受到脱靶编辑增加、意外插入缺失（indels）和潜在毒性双链断裂（DSBs）的限制。相比之下，先导编辑器（Prime Editor）——一种Cas9切口酶与工程化莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（MMLV RT）及先导编辑向导RNA（pegRNA）配对——可以在不诱导双链断裂（DSBs）的情况下安装多种替换、小插入或缺失。同时，研究人员及其他团队开发了PEDAR、PRIME-Del或twinPE，其中一对pegRNA指导精准基因组删除。更近期，Doman等人发现将Cas9切口酶与来自Tf1逆转座子的进化逆转录酶（PE6c）配对，与使用MMLV RT的进化PE变体（如PE2、PE3和PEmax）相比，可在多种靶点上增强编辑效率。 在本研究中，研究人员表明，使用PE6c的twinPE可在不同细胞类型中精准删除GAA重复序列并恢复FXN蛋白表达。此外，研究人员采用治疗相关的病毒样颗粒（VLPs）将twinPE递送至患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）和iPSC来源的神经元中，反映了FRDA病理学中关键的神经学贡献。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

弗里德赖希共济失调（Friedreich's ataxia，FRDA）是一种罕见的常染色体隐性神经退行性疾病，属于重复扩增疾病（Repeat Expansion Diseases，REDs）家族。该疾病的分子病理基础在于frataxin（FXN）基因第一个内含子中鸟嘌呤-腺嘌呤-腺嘌呤（GAA）三核苷酸重复序列的病理性扩增：健康个体通常携带5–30个GAA重复，而FRDA患者携带55至超过1700个重复。长GAA重复序列可形成RNA/DNA杂交体（R-loops），损害RNA聚合酶II的转录延伸，导致FXN基因转录沉默和蛋白水平降低。FXN蛋白缺陷进而损害线粒体铁代谢，干扰铁硫簇合成，引发氧化应激。病理改变最显著的部位包括背根神经节、脊髓、脑干和小脑，临床表现为步态共济失调、肌无力、感觉丧失、脊柱侧凸、眼球运动障碍、视力及听力损伤和肥厚型心肌病。晚期患者丧失独立行走能力，多数需永久依赖轮椅，严重心肌病或心律失常可导致过早死亡，许多患者寿命不超过40岁。

现有治疗策略存在明显局限。Omaveloxolone通过激活核因子红细胞2相关因子2（NRF2）保护细胞免受氧化应激，但缺乏特异性；基于腺相关病毒（AAV）的基因治疗LX2006通过外源构建体增加FXN蛋白水平，但存在FXN过表达引发心脏毒性和肝毒性的风险；基于寡核苷酸的基因激活方法效力及特异性尚不足以满足治疗需求。因此，迫切需要能够直接删除GAA重复扩增、在FXN基因内源调控环境中靶向根本遗传病因的治疗策略。

此前研究虽已报道利用Cas9核酸酶或碱基编辑器删除或中断GAA重复，但Cas9方法受限于脱靶编辑增加、意外插入缺失（indels）以及潜在毒性双链断裂（DSBs）。先导编辑（Prime Editor）作为一种不依赖DSB的精准基因编辑技术，由Cas9切口酶与工程化逆转录酶及先导编辑向导RNA（pegRNA）组成，可安装多种替换、小插入或缺失。twinPE技术利用一对pegRNA指导精准基因组删除，为本研究提供了技术基础。

二、研究内容与核心结论

本研究旨在利用twinPE技术精准删除FXN基因内含子1中的致病性GAA重复序列，并通过RNA或病毒样颗粒（VLPs）递送方式，在不同细胞模型中验证该策略的有效性、精准性和治疗潜力。研究结果表明，twinPE可在HEK293T细胞、FRDA患者成纤维细胞、患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）及iPSC来源的运动神经元（iMNs）中实现GAA重复序列的高效精准删除，并恢复FXN基因的mRNA和蛋白表达水平，为FRDA及其他重复扩增疾病的基因治疗提供了新策略。

三、关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：twinPE双pegRNA系统（以细菌附着位点attB作为逆转录模板RTT，介导约1.2 kb的删除和attB插入）；PE6c效应器（使用来自Tf1逆转座子的进化逆转录酶）；全RNA递送系统（体外转录（IVT）制备N1-甲基假尿苷修饰的PE6c mRNA，化学合成经2′-O-甲基和3′-硫代磷酸酯修饰的pegRNA，通过电穿孔递送）；病毒样颗粒（VLPs）递送系统（比较FMLV VLPs和ENVLPE? VLPs两种系统）；液滴数字PCR（ddPCR）定量编辑效率；深度测序（NGS）分析编辑精准度；Western blot检测蛋白表达恢复；RT-qPCR检测mRNA表达水平。细胞样本来源包括：HEK293T细胞（ATCC）、GM03816 FRDA患者成纤维细胞（携带约330/380个GAA重复）、GM23404 iPSCs（由GM03816成纤维细胞重编程而来）、GM23923 iPSCs（携带约541/420个重复）及GM25256健康对照WT iPSCs，均购自Coriell医学研究所。

四、研究结果

twinPE介导FXN内含子1中GAA重复序列的删除。 研究人员设计了五个正向和四个反向间隔序列（spacers）锚定GAA重复区域两侧，以38-bp细菌附着位点（attB）作为逆转录模板（RTT），在HEK293T细胞中筛选了19对工程化pegRNA（epegRNA）与PE6c或PE6d效应器的组合。ddPCR定量结果显示，F1和R1 pegRNA对与PE6c组合时删除效率最高，约达48.0%。转染后第3、7、14天的编辑效率检测表明重复序列删除具有稳定性。比较不同RTT序列时发现，以6xGAA重复（18 bp）或6xGAA加20-bp 3′端同源翼作为RTT虽也能产生强删除条带，但Sanger测序显示序列组成更异质，推测重复序列作为RTT可能导致重复之间的“滑移”杂交。因此后续研究选用attB作为RTT。深度测序分析显示，大多数读段为删除加attB插入，但部分读段缺乏完整插入，表现为靶序列间通过微同源序列（如“GTT”或“GGC”）连接的删除，提示微同源介导的末端连接（MMEJ）修复通路的参与。脱靶分析方面，利用Cas-OFFinder进行计算机预测，选择含≤1-nt DNA或RNA bulge及≤3-nt错配的潜在脱靶位点，连接PCR和NGS分析均未在任何脱靶位点检测到预期连接条带或attB插入。

twinPE在GM03816患者来源成纤维细胞中介导GAA重复删除。 GM03816 FRDA患者成纤维细胞在一个FXN等位基因上携带约330个GAA重复，另一个携带约380个重复。研究人员开发了全RNA-based twinPE系统，通过电穿孔将IVT制备的PE6c mRNA和化学修饰的F1/R1 pegRNA递送入细胞。PCR分析确认了预期删除产物，Sanger测序显示attB的精准插入。剂量反应实验显示，在1.3 μg PE6c mRNA条件下编辑效率达到13.3%。该结果表明twinPE与全RNA电穿孔递送格式兼容。

twinPE在GM23404 iPSCs中介导GAA重复删除并恢复FXN表达。 研究人员将F1和R1 pegRNA与PE6c mRNA电穿孔导入GM23404 iPSCs（330/380重复），PCR确认了888-bp编辑产物和约3-kb野生型产物。ddPCR定量显示，电穿孔后第3天编辑效率约为40.6±1.8%，第14天为43.5±4.3%，表明重复序列删除的稳定性。RT-qPCR分析显示，twinPE处理细胞的FXN mRNA表达较未处理细胞增加约两倍，而Cas9处理细胞中FXN mRNA表达未见增加。Western blot分析显示，twinPE使中间型frataxin（FXN 42–210，18 kDa）表达从非处理iPSCs的56.3%增加至93.2%，成熟型frataxin亚型（FXN 81–210，14 kDa）从36.7%增加至66.0%，表明删除GAA重复后iPSC群体中蛋白表达部分恢复。在第二株iPSC系GM23923（420/541重复）中，twinPE介导了25.0%的删除效率，FXN mRNA表达从24.3%增加至50.1%。深度测序分析显示，在HEK293T细胞、FRDA成纤维细胞和FRDA iPSCs中，超过95%的编辑读段对应完美预期编辑。

利用病毒样颗粒（VLPs）将TwinPE递送至FRDA iPSC来源的运动神经元（iMNs）。 研究人员将FRDA iPSCs（330/380）分化为iMNs，比较了MessengerMAX转染和电穿孔两种方法。电穿孔导致大量细胞死亡，编辑效率仅1–2%；MessengerMAX毒性较低但编辑效率约5%。作为替代递送策略，研究人员测试了两种VLP系统：FMLV VLPs和ENVLPE? VLPs。通过共转染编码VSV-G、Gag-Pol、iPE-P2A-Csy4和两个pegRNA的质粒产生VLP，收集上清并用PEG-it溶液浓缩。在HEK293T细胞中验证了VLP递送twinPE的可行性，PCR确认了预期删除。ddPCR分析显示ENVLPE? VLPs在FRDA iPSCs中的表现优于FMLV VLPs。用携带mGreenLantern的ENVLPE? VLPs转导iMNs后观察到GFP阳性细胞，证明VLP能成功将货物递送至神经元。在iMNs中，ENVLPE? VLPs携带twinPE的编辑效率为12.3%，NGS数据显示超过98%的编辑读段为完美预期编辑。

五、讨论与结论

研究人员在讨论中指出，twinPE在多种细胞类型中实现了高效精准的GAA重复删除，编辑效率分别为HEK293T细胞48.0%、成纤维细胞13.3%、iPSC（330/380）40.6%、iPSC（420/541）25.04%和iMNs 12.3%。值得注意的是，该策略在有丝分裂后细胞模型（如iMNs）中展现了编辑效力，这是大多数体内应用的关键要求。所有细胞类型中精准编辑比例持续保持在95%–98.2%的高水平，凸显了twinPE相较于依赖DSB的核酸酶编辑器具有更优的保真度。NGS分析提示HEK293T细胞中可能存在MMEJ通路的参与，为脱靶编辑结果提供了机制性见解。研究人员提出，未来可探索MMEJ抑制剂或MMEJ/DNA-PK双重抑制剂是否能调节GAA重复收缩和attB整合的精准度与效率。

attB被证明是twinPE介导基因组删除的有效RTT序列，可显著减少因“滑移”杂交引起的噪声删除。不同RTT的GC含量差异（attB为63%，6xGAA为33%，6xGAA加20-nt 3′突出为37%）提示GC组成可能影响编辑保真度和效率。与既往使用质粒DNA电穿孔递送配对先导编辑器的研究相比，本研究建立了全RNA递送方法在FRDA iPSC模型中的可行性。VLPs成功将twinPE直接递送至iMNs，编辑效率显著高于脂质介导转染或电穿孔。这是首次通过VLP递送实现PE6c介导的GAA重复删除于FRDA患者来源iPSCs和iMNs的报道。iMNs中编辑效率低于iPSCs，可能归因于神经元周围致密的神经周网（PNNs）阻碍病毒接近神经元细胞表面。VSV-G假型VLPs可利用神经元表达的低密度脂蛋白受体（LDLR）实现高效转导，使VLPs成为神经元递送的有前景工具。YG8-800小鼠模型被提出作为体内验证的候选模型。

研究结论：研究结果确立了twinPE——以RNA或VLPs形式递送——作为一种通用且有效的GAA重复收缩策略，可恢复FXN表达。该研究为twinPE介导的基因组编辑作为FRDA及其他重复扩增疾病的潜在治疗策略奠定了基础。