《Emerging Contaminants》：AOP-ontology-guided QSAR pipeline Machine and Deep Learning: Prediction and Mechanistic Interpretation of Female Reproductive Injury
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中文翻译（摘要）
为探索具有雌激素干扰效应的物质，有必要开发诱导雌性生殖干扰效应的最优预测模型，以替代传统的体内实验研究方法。研究人员聚焦于与雌性生殖损伤相关的五条不良结局通路（adverse outcome pathways, AOPs），为每条AOP中的各
中文翻译（摘要）
为探索具有雌激素干扰效应的物质，有必要开发诱导雌性生殖干扰效应的最优预测模型，以替代传统的体内实验研究方法。研究人员聚焦于与雌性生殖损伤相关的五条不良结局通路（adverse outcome pathways, AOPs），为每条AOP中的各分子起始事件（molecule-initiated events, MIE）和关键事件（key event, KE）建立了最优机器学习或深度学习预测模型。Morgan指纹（Morgan fingerprint）结合随机森林（random forest）在预测雌性生殖干扰效应方面表现最佳。此外，研究人员发现了1127种环境激素通过刺激哪些AOPs实现毒性效应，以及这些化合物中具有触发AOPs潜力的子结构。三丁基锡化合物主要通过AOP7、AOP549和AOP289通路干扰雌性生殖。进一步的分子对接研究发现，与这些子结构具有良好结合活性的关键蛋白。其中，含硝基苯基结构的化合物与AOP289中的5α-还原酶（5α-reductase）和卵黄蛋白原（vitellogenin）具有强结合活性。该研究为预测化合物是否具有雌性生殖干扰效应及探索其毒性机制提供了新的研究视角和方法。
论文解读
一、研究背景与意义
环境中的某些化学物质暴露会导致生殖损伤效应，尤其是雌性生殖系统损伤。一些合成化合物具有类似雌激素的活性，被称为外源性雌激素或环境雌激素，广泛存在于农药、表面活性剂、洗涤剂、塑料和工业化学品中。外源性雌激素可改变内分泌系统功能，对生物体及其后代造成有害健康效应，并威胁生态环境。传统上，评估化合物雌性生殖毒性主要依赖动物实验等体内毒性评价方法，但这类方法存在周期长、资金消耗大以及动物福利和伦理问题等缺点。因此，借助深度学习等计算机技术预测化合物是否具有雌性生殖损伤效应十分必要且意义重大。
不良结局（adverse outcome, AO）是生殖顶端效应在器官/个体水平的表现，如生育力下降、卵巢周期紊乱、卵巢功能障碍和不孕等。将不良结局通路（AOP）与药物生物活性预测模型相结合，不仅能预测化合物活性，还能阐明其潜在毒理学机制，为风险评估和管理提供更全面、可预测的信息。在AOP框架中，化学物质与分子起始事件（MIE）相互作用，激活一系列关键事件（KE）。目前已有大量实验生物学数据可供利用，如雌激素活性数据库（EADB）和ToxCast数据库，为建立模型提供了理想的数据资源。
以往研究多集中于化合物对雌激素受体（ER）的影响，基于AOP知识预测化合物导致雌性生殖干扰的模型较少。考虑到AO的触发是一系列KE和MIE作用的结果，综合考虑化合物在每个KE和MIE上的生物活性来预测化合物是否产生雌性生殖干扰效应更为全面、合理和有效。该研究旨在利用AOP知识开发机器学习和深度学习模型，预测并揭示化合物对雌性生殖的损伤效应及其机制。
二、主要技术方法
研究人员从AOP Wiki网站以“female”为关键词检索，筛选出五条与雌性生殖损伤相关的AOPs，包括AOP345、AOP7、AOP549、AOP100和AOP289。基于ToxCast数据库和文献检索获取各MIE和KE对应的化合物活性数据，化合物规范SMILES字符串来自PubChem数据库。同时收集了1127种具有环境激素效应的化合物列表用于模型应用预测。对于小样本MIE/KE数据集，采用SMILES枚举进行数据增强，将原始数据约扩增10倍，仅引入训练集以避免数据泄漏。模型开发中比较了四种分子指纹（MACCS、RDKFingerprint、FCFP和Morgan指纹）与六种算法（随机森林RF、K近邻KNN、支持向量分类SVC、朴素贝叶斯NB、AdaBoost决策树ADT和深度神经网络DNN）的组合效果。采用分层随机划分（80%训练/20%外部测试集），在训练集上仅应用SMOTE过采样防止数据泄漏，并通过5折分层交叉验证进行超参数调优。此外，利用SARpy工具进行结构预警（SA）分析，采用AutoDock Vina进行分子对接研究，评估结构预警子结构与各AOP关键蛋白的结合活性。
三、研究结果
3.1 与雌性生殖损伤相关的AOPs
AOP345将AR拮抗作用（MIE26）通过三个关键事件——AR活性降低（KE1614）、AR基因转录改变（KE286）和颗粒细胞增殖减少（KE1800）——与卵巢周期紊乱（AO405）和雌性生育力降低（AO406）联系起来。AOP7涉及卵巢颗粒细胞减少和芳香化酶（cyp19a1）抑制（MIE408），随后破坏激素平衡（KE291和KE3），导致卵巢周期紊乱（AO405），进而可能引起生育力受损（AO406）。AOP549描述芳香化酶抑制可诱导成年雌性斑马鱼的生殖毒性，包括生长和发育毒性，其路径为芳香化酶抑制（MIE36）、血浆芳香化酶活性抑制（KE2277）、血浆17β-雌二醇和卵黄蛋白原浓度降低（KE219和KE221）、卵母细胞中卵黄蛋白原沉积减少及随后的卵母细胞成熟和发育障碍（KE309）。AOP100包括环加氧酶活性抑制（MIE79）、血浆和卵巢中前列腺素F2α浓度降低（KE671和KE672）、产卵行为和吸引配偶能力降低（KE673和KE674），最终导致繁殖成功率降低（AO675）和种群增长率下降（AO360）。AOP289描述5α-还原酶抑制（MIE1617）导致循环DHT浓度下调（KE1613），进而导致雌性17β-雌二醇（E2）丰度（KE219）和血浆卵黄蛋白原浓度（KE221）降低，与产卵量和产卵活动减少（KE78）相关。
3.2 各MIE和KE的最佳预测模型
与其它分子指纹相比，Morgan指纹在除MIE79和KE671外的所有MIE和KE中表现最佳。FCFP和MACCS分别在MIE79和KE671中表现最优。与其它深度或机器学习算法相比，随机森林在大多数MIE和KE中表现更优，SVC在KE286和KE1800中表现最佳。总之，Morgan指纹结合随机森林在预测雌性生殖损伤活性方面表现最佳。除MIE79和KE671外，所有最佳预测模型的准确率、AUC和F1分数均大于0.900。对于KE221、KE309、KE672、KE673、KE674、MIE1617、KE1613和KE78，准确率、AUC和F1分数均为1.000，这可能归因于这些化合物数据量较小。
3.3 环境激素化合物对雌性生殖的影响
当化合物在AOP中所有KE/MIE上均表现为活性时，认为该化合物通过该AOP通路对雌性生殖产生干扰效应。4'-羟基-2,4,6-三氯联苯、4-苯基苯酚和4,4'-联苯酚在AOP345的所有KE/MIE上均表现为活性。在1127种环境激素化合物中，分别有21、40、105和26种化合物通过AOP7、AOP549、AOP100和AOP289通路对雌性生殖产生干扰效应。此外，在AOP7、AOP549和AOP289所有KE/MIE上均显示活性的化学物质大多为三丁基锡化合物。
3.4 环境激素化合物的结构预警
含4-羟基联苯结构的化合物通过干扰雄激素受体（AOP345）影响雌性排卵周期和生育率。含三丁基锡、二苯基锡或二正丁基锡结构的化合物会降低芳香化酶（CYP19A1）导致成年雌性生育力受损（AOP7/549），其中三丁基锡和二正丁基锡类化合物还抑制5α-还原酶，导致DHT和17β-雌二醇降低，引起雌鱼繁殖力受损（AOP289）。含苄基结构的化合物不仅能降低CYP19A1导致成年雌性生育力受损（AOP7/549），还能抑制环加氧酶导致雌性产卵行为受抑引起的繁殖功能障碍（AOP100）。含硝基苯基结构的化合物可通过AOP7、AOP100和AOP289通路干扰雌性生殖。
3.5 结构预警与靶蛋白的分子对接
4-羟基联苯结构与雄激素受体结合良好，结合能为-6.22 kcal/mol，通过疏水作用、氢键和π-堆积结合。二苯基锡、二硝基甲苯和苄基结构与Cyp19a1和PPARγ具有良好结合活性。在AOP549中，二苯基锡和苄基结构与Cyp19a1和卵黄蛋白原均具有结合活性，含氯环状结构和双酚A结构也与卵黄蛋白原具有结合活性。含硝基苯基结构的化合物与5α-还原酶和卵黄蛋白原具有强结合活性，结合能低于-7.0 kcal/mol，主要通过疏水作用结合。对接分析表明，含硝基苯基的化学物质与5α-还原酶的LEU-169和GLU-342关键残基以及卵黄蛋白原的TRP-22残基相互作用。
3.6 适用域评估
基于杠杆值和Morgan-2指纹最大Tanimoto相似性对17个MIE-KE QSAR模型分别进行适用域评估。对于基于ToxCast测定构建的大数据集模型，80.0%-91.5%的1127种测试化合物落在共识适用域内。而文献来源的小样本模型（即使经过SMILES枚举增强）的域内覆盖率较低，为59.7%-63.4%。在整个测试库中，69.6%的化合物至少在17个MIE-KE模型中的14个处于域内，10.7%的化合物在超过一半模型中处于域外，这些易出域化合物主要是高度卤化的持久性有机污染物和全氟/多氟化合物。
四、讨论与结论
已有研究开发了用于预测EDCs生殖毒性的种间相关估计（ICE）和SVM模型，但其生殖毒性数据为无观察效应浓度（NOEC）终点，未区分生殖毒性效应类型，也未揭示机制。该研究建立的模型可预测化合物在多个AOP中的表现，从而发现化合物生殖毒性的作用路径，为体内实验研究提供初步参考。研究中发现的若干触发相应AOP的典型子结构与既往体内实验结果一致：4-羟基联苯被证实可竞争性抑制AR结合；三丁基锡和三苯基锡可抑制芳香化酶；硝基苯基具有抗雄激素和弱雌激素特性，暴露于4-硝基苯酚的雌性小鼠体外受精后受精率降低、囊胚形成受损且后代减少；含苄基化合物通过芳香化酶影响雌性生殖，也可通过抑制环加氧酶影响雌性生殖；含硝基苯基结构化合物可通过抑制5α-还原酶和DHT影响雌性生殖，即AOP289通路。分子对接结果与既往报道一致，同时填补了硝基苯基化合物与5α-还原酶和卵黄蛋白原对接研究的数据空白。
研究结论：聚焦于雌性生殖损伤相关的AOPs（AOP345、7、549、100和289），研究人员为五个AOP事件中的每个MIE和KE建立了最优机器学习或深度学习QSAR预测模型。Morgan指纹结合随机森林在预测雌性生殖干扰效应方面表现最佳。在1127种环境激素化合物中，分别有21、40、105和26种化合物通过AOP7、AOP549、AOP100和AOP289通路对雌性生殖产生干扰效应。研究发现了三丁基锡化合物主要通过AOP7、AOP549和AOP289通路干扰雌性生殖，含硝基苯基结构的化合物与AOP289中关键蛋白5α-还原酶和卵黄蛋白原具有强结合活性。该研究建立的模型可预测化合物在多个AOP中的表现，从而发现化合物生殖毒性效应的作用路径，为体内实验研究提供初步参考，并为环境内分泌干扰物的风险治理提供更高效的技术支持。
