典型PPD与PPDQ化合物的免疫毒性研究：基于网络毒理学与实验验证的整合分析

《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：Insights into the immunotoxicity of typical PPD and PPDQ compounds through integrating network toxicology and experimental validation

　　

摘要专业翻译 轮胎磨损颗粒（TWPs）是新兴环境污染物的重要来源，其中对苯二胺类化合物（PPDs）及其醌类衍生物（PPDQs）作为轮胎抗氧化剂广泛释放至环境中。尽管6PPD和6PPDQ已被广泛研究，其他PPD相关化合物的免疫毒性仍未充分阐明。本研究系统评估了三种典型化合物——77PD、IPPDQ和6PPDQ——在THP-1来源巨噬细胞中的免疫毒性效应。研究人员发现，77PD和IPPDQ以剂量依赖方式诱导巨噬细胞凋亡，而6PPDQ则表现出非单调性凋亡效应。所有三种化合物均损害巨噬细胞的吞噬功能、趋化因子信号轴表达及对金黄色葡萄球菌（S. aureus）的杀菌能力，并诱导M1/M2混合型极化相关基因表达谱。网络毒理学分析鉴定了各化合物与免疫损伤相关的核心靶点，KEGG富集分析提示PI3K-AKT信号通路为共同的关键通路。分子对接和分子动力学模拟进一步预测了化合物与EGFR、AKT1等核心蛋白的稳定结合。qPCR验证表明，三种化合物均引起PI3K-AKT通路相关基因的转录失调，且与极化标志物和凋亡指标显著相关。本研究首次系统揭示了77PD和IPPDQ的免疫毒性潜力，拓展了对轮胎来源新兴污染物免疫干扰机制的认识。

论文解读

一、研究背景与科学问题

随着汽车工业的快速发展，轮胎磨损颗粒（TWPs）已成为全球性环境污染物，每年释放量约6亿吨。轮胎抗氧化剂对苯二胺类化合物（PPDs）及其醌类衍生物（PPDQs）随轮胎磨损进入环境，在空气、水体、土壤和生物样本中广泛检出。此前研究已证实6PPDQ是城市径流致死综合征的关键毒物，并可在哺乳动物中引起多器官毒性。然而，环境监测显示其他PPD/PPDQ类化合物如77PD和IPPDQ在多种介质中的浓度与6PPDQ相当甚至更高，但其免疫毒性尚未得到系统评估。巨噬细胞作为先天免疫的核心效应细胞，其吞噬、杀菌、极化等功能状态直接决定宿主防御能力。现有研究仅关注6PPDQ对巨噬细胞的影响，对77PD和IPPDQ的免疫毒性知之甚少，亟需系统研究。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员选用THP-1单核细胞系经佛波酯（PMA）诱导分化为巨噬细胞模型，评估三种化合物的免疫毒性。主要关键技术包括：CCK-8法检测细胞活力；流式细胞术（Annexin V-FITC/PI双染）检测凋亡；中性红摄取实验评估吞噬功能；金黄色葡萄球菌感染模型评估杀菌活性；qPCR检测趋化因子、极化标志物及PI3K-AKT通路基因表达；网络毒理学分析（SwissTargetPrediction、CTD、SuperPred、PharmMapper、GeneCards、STRING、Cytoscape、DAVID）构建化合物-靶点-通路网络；分子对接（AutoDockTools）及分子动力学模拟（GROMACS）预测化合物与核心靶蛋白的相互作用。

三、主要研究结果

3.1 细胞毒性及凋亡效应：CCK-8实验显示三种化合物均呈剂量和时间依赖性降低THP-1细胞活力，77PD的IC₅₀为1.46 μM，IPPDQ和6PPDQ在≥5 μM时产生显著毒性。流式凋亡检测发现，77PD在0.000001 μM即显著诱导凋亡，IPPDQ在1 μM诱导凋亡，而6PPDQ表现出非单调性效应（低剂量促进凋亡，高剂量抑制凋亡）。

3.2 巨噬细胞免疫功能受损：三种化合物均显著抑制巨噬细胞吞噬功能，并下调趋化因子CCL2、CX3CL1及其受体CCR2、CX3CR1的表达。杀菌实验显示，77PD剂量依赖性地降低巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的清除能力；IPPDQ在低剂量（0.001 μM）抑制杀菌，高剂量（1 μM）增强杀菌；6PPDQ在低剂量（0.001 μM）显著抑制杀菌功能。

3.3 巨噬细胞极化改变：qPCR结果显示，77PD低剂量促进M1样极化（TNF、IL6、IL1β升高，CD86下降），高剂量同时诱导M2标志物CD206升高；IPPDQ和6PPDQ均诱导M1/M2混合极化表型，表现为促炎因子和抗炎因子同步上调。

3.4 网络毒理学分析：整合数据库获得77PD、IPPDQ、6PPDQ相关靶点分别为305、357、1757个，与免疫损伤靶点交集后获得281、325、986个共享基因。PPI网络分析鉴定出72、88、278个核心靶点。KEGG富集分析一致显示PI3K-AKT信号通路和脂质与动脉粥样硬化通路为三种化合物共同的关键通路。

3.5 分子对接与动力学模拟：分子对接显示77PD与EGFR结合最强（-6.53 kcal/mol），IPPDQ与EGFR结合（-5.55 kcal/mol），6PPDQ与EGFR结合最强（-8.17 kcal/mol）。50 ns分子动力学模拟证实各复合物结构稳定，RMSD、Rg及氢键分析均支持稳定结合。

3.6 PI3K-AKT通路验证：qPCR验证显示，77PD显著降低PIK3CA、AKT2、PTEN表达，升高PIK3CD、PDK1；IPPDQ显著上调PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、AKT1、AKT2、PDK1并抑制PTEN；6PPDQ上调PIK3CD、AKT1，抑制PTEN、AKT2。相关性分析显示PI3K-AKT通路基因与极化标志物及凋亡指标显著相关。

三、讨论与结论

讨论部分指出，三种化合物通过不同机制破坏巨噬细胞功能：77PD主要通过诱导凋亡导致免疫抑制；IPPDQ高剂量通过上调NOS2增强杀菌能力但伴随异常激活；6PPDQ抑制凋亡可能延长炎症反应。PI3K-AKT信号通路是共同的关键调控网络，但各化合物对该通路的调控模式存在差异，这与AKT1/AKT2对巨噬细胞极化的差异调控一致。分子对接预测的靶蛋白（EGFR、HSP90AA1、SRC、STAT3、TP53等）均参与免疫调节。

研究结论：本研究首次系统评估了77PD和IPPDQ在免疫细胞模型中的免疫毒性。77PD和IPPDQ促进巨噬细胞凋亡，6PPDQ表现出非单调性效应。所有化合物均损害巨噬细胞免疫功能和极化谱，PI3K-AKT信号通路可能参与PPD/PPDQ诱导的免疫应答。研究扩展了对轮胎新兴污染物免疫干扰机制的认识，为环境健康风险评估提供了重要科学依据。论文发表于《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》。