过氧化氢处理制备紫菜藻红蛋白基色素蛋白的结构、颜色及稳定性研究

《Food Chemistry: X》：Structural, color, and stability properties of hydrogen peroxide-treated phycoerythrin-based colorant proteins from dried laver ( Pyropia yezoensis)

　　

本研究探讨了过氧化氢（H2O2）处理对基于藻红蛋白（Phycoerythrin, PE）的色素蛋白（PE-based colorant protein, PBCP）的结构、颜色及稳定性的影响。H2O2处理降解了藻蓝蛋白（Phycocyanin, PC），从干紫菜（Pyropia yezoensis）中获得了红色PBCP。与通过硫酸铵沉淀（(NH4)2SO4 precipitation, AS）和离子交换色谱（Ion-exchange chromatography, IE）制备的PE相比，PBCP具有更高的蛋白质含量。H2O2诱导的聚集和结构重排增强了PBCP的稳定性。PBCP作为一种天然色素，为海藻生物精炼中的食品应用提供了可能。

研究背景与目的

海藻生物精炼产业因其高可持续性和碳水化合物生物质的稳定供应而备受关注。红藻如紫菜（Pyropia spp.）富含半乳糖基多糖，是理想的生物精炼原料。然而，建立一个全面的紫菜生物精炼体系不仅需要利用多糖，还需要对水溶性蛋白组分进行高值化利用。紫菜中的水溶性蛋白富含色素蛋白，包括藻胆蛋白（Phycobiliproteins）。其中，藻红蛋白（Phycoerythrin, PE）作为红藻中主要的藻胆蛋白，因其高摩尔消光系数、宽激发光谱和优异的荧光特性，在天然染料、荧光材料和生物活性成分方面具有巨大潜力。但PE对热、光等物理化学因素敏感，因此需要建立能够保持其颜色和结构完整性的提取和分馏条件。传统的硫酸铵沉淀（AS）、离子交换色谱（IE）、膜过滤和水相两相系统等方法存在选择性差、色素降解、处理时间长以及设备和运营成本高等局限性，阻碍了其在工业规模上的应用。因此，开发一种既能简化处理步骤又能维持PE颜色和结构完整性的选择性分馏策略至关重要。

过氧化氢（H₂O₂）处理可导致蛋白质发生氧化和结构变化，当控制得当时，可以利用不同蛋白质对氧化的敏感性差异来实现选择性变性和分馏。此外，氧化诱导的结构修饰可以促进蛋白质聚集并改变官能团的反应性，从而增强乳化能力、发泡特性和加工稳定性等功能特性。但残留的H₂O₂可能引起持续氧化，导致过度结构变化和储存稳定性下降。过氧化氢酶（Catalase）能有效分解残留H₂O₂为水和氧气，终止氧化反应。H₂O₂与过氧化氢酶的联合使用已在奶酪、鸡蛋和鱼卵等多种食品体系中证明是适用且安全的。这种结合过氧化氢酶终止反应的H₂O₂处理方法，为从紫菜复杂的水溶性蛋白提取物中选择性分馏特定蛋白质提供了一种简化的技术。

本研究旨在开发一种基于H₂O₂和过氧化氢酶的选择性分馏工艺，从紫菜提取物中生产出一种具有增强物理化学稳定性的含PE色素组分（PBCP）。研究人员评估了所得PBCP的颜色和结构特征、在不同加工条件下的稳定性及其与食品应用相关的功能特性。

关键技术方法

1. 1.
   样品制备与PBCP/PE的获取：将干紫菜（P. yezoensis）粉末与水混合提取水溶性蛋白，获得紫菜提取物（对照组）。向提取物中添加30%（w/w）H₂O₂至终浓度0.5-5.0 mol/L，于25°C孵育8小时，之后加入过氧化氢酶（60 U/mL）分解残留H₂O₂，离心去除变性蛋白后得到PBCP。同时，采用顺序AS沉淀法（15%、30%、40%饱和度分级沉淀）和DEAE-Sepharose离子交换色谱（IE）法制备纯PE样品作为对照。
2. 2.
   表征方法：
   • •
     色素含量测定：使用UV-Vis分光光度计在450-700 nm扫描，通过比色法公式计算藻蓝蛋白（PC）、PE和别藻蓝蛋白（Allophycocyanin, APC）的含量。
   • •
     蛋白质产率：采用双缩脲法（Biuret method）在540 nm处测定蛋白质浓度。
   • •
     H₂O₂含量：使用KI/[NH₄]₆Mo₇O₂₄试剂显色，在350 nm处测量吸光度，依据朗伯-比尔定律（Beer-Lambert law）计算。
   • •
     颜色测定：使用Lovibond RT系列色度计测量CIE Lab坐标（L亮度、a红度、b黄度）。
   • •
     量子化学计算：对藻红胆素（Phycoerythrobilin, PEB）和藻蓝胆素（Phycocyanobilin, PCB）两种发色团，使用Avogadro软件建模，ORCA程序在B3LYP/6-31+G(d,p)水平上进行密度泛函理论（DFT）计算，评估H₂O₂处理的影响。

研究结果

2.2.3.1 PC、PE和APC含量

通过比色法分析发现，H₂O₂处理显著改变了色素蛋白组成。随着H₂O₂浓度的增加和处理时间的延长，PC的特征吸收峰逐渐减弱直至消失，表明PC被优先降解。PE的吸收峰得以保留，使得最终获得的PBCP呈现红色。与AS和IE法制备的PE相比，PBCP中的PE纯度相对较低，但总蛋白含量更高。

2.2.3.2 蛋白质产率

双缩脲法测定结果表明，PBCP的总蛋白产率显著高于传统AS和IE法获得的PE。这说明H₂O₂处理不仅去除了非目标蛋白（主要是PC），还保留了更多的总蛋白，提高了蛋白利用率。

2.2.3.3 H₂O₂含量

通过检测发现，经过过氧化氢酶处理后，PBCP样品中残留的H₂O₂被有效清除，确保了后续实验的安全性，避免了持续氧化对产物稳定性的负面影响。

2.2.3.4 颜色

色度计测量结果显示，PBCP呈现出明亮的红色，其CIE Lab参数与天然PE相比有所变化。具体而言，PBCP的a值（红度）较高，表明其红色特征明显；L值和b值的变化则反映了H₂O₂处理引起的结构改变对颜色的影响。

2.2.4 量子化学计算

DFT计算结果显示，PE的发色团PEB具有较高的绝热电离势（Adiabatic Ionization Potential, AIP）和垂直电离势（Vertical Ionization Potential, VIP），而PC的发色团PCB则表现出较低的AIP和VIP。这意味着PCB更容易失去电子，即更容易被H₂O₂氧化。这从分子层面解释了为何H₂O₂处理会选择性地降解PC而保留PE。

讨论与结论

讨论部分总结：研究表明，H₂O₂处理是一种有效的选择性分馏策略，可以从紫菜粗提物中富集PE。其机制在于PC的发色团PCB比PE的发色团PEB更易被氧化，导致PC优先变性沉淀而被去除。同时，H₂O₂处理诱导了PE分子的适度氧化交联和结构重排，形成了更稳定的聚集体。这种结构变化虽然可能略微降低PE的荧光强度，但显著提升了其对热、光和pH变化的耐受性。与传统的AS和IE方法相比，该方法流程更短、成本更低，且获得了更高的总蛋白回收率，尽管PE的纯度略低。PBCP良好的颜色和稳定性使其成为食品工业中合成红色素的潜在天然替代品。

研究结论：研究人员成功开发了一种基于H₂O₂和过氧化氢酶的处理工艺，用于从紫菜水溶性蛋白提取物中选择性生产富含PE的色素蛋白（PBCP）。该工艺利用PC发色团（PCB）与PE发色团（PEB）对氧化敏感性的差异，实现了PC的有效去除和PE的富集。H₂O₂处理诱导的蛋白质聚集和结构重排显著增强了PBCP的物理化学稳定性。与通过硫酸铵沉淀和离子交换色谱制备的传统PE相比，PBCP具有更高的总蛋白含量和相当的着色性能。这项研究为紫菜生物精炼过程中水溶性蛋白组分的高值化利用提供了新的工艺基础，并为含PE色素作为功能性食品配料的应用拓展了可能性。