《Frontiers in Neurology》：Cuproptosis-related molecular alterations in a neonatal rat model of hypoxic–ischemic brain damage
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背景：铜稳态失衡与多种神经系统疾病的进展密切相关。铜死亡（cuproptosis）是一种新近发现的由细胞内铜异常积累引起的细胞死亡形式，其与缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）的关系尚不明确。本研究旨在表征新
背景：铜稳态失衡与多种神经系统疾病的进展密切相关。铜死亡（cuproptosis）是一种新近发现的由细胞内铜异常积累引起的细胞死亡形式，其与缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）的关系尚不明确。本研究旨在表征新生大鼠HIBD病理过程中与铜死亡相关的分子改变。方法：采用改良Rice–Vannucci法建立新生大鼠HIBD模型。应用激光多普勒血流仪测量脑血流，通过2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色评估梗死体积。利用组织学染色和透射电子显微镜评估脑组织损伤及线粒体超微结构变化。采用特异性检测试剂盒检测脑组织中的氧化应激标志物和铜离子水平。运用免疫荧光染色观察神经细胞中二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶（DLAT）的表达，并通过蛋白质印迹法分析铜死亡相关蛋白的表达。结果：与假手术组相比，HIBD组损伤侧大脑半球的灌注显著降低，并伴有液化性坏死和组织萎缩。此外，铜离子和活性氧（ROS）水平升高，谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）水平降低，表明HIBD导致铜稳态失衡和氧化应激。染色结果显示，HIBD组胶质细胞活化、神经元丢失以及DLAT表达广泛下调，提示存在神经炎症反应和细胞代谢紊乱。进一步研究发现，铜死亡相关蛋白铁氧还蛋白1（FDX1）和热休克蛋白70（HSP70）表达上调，而硫辛酸合成酶（LIAS）、线粒体乌头酸酶2（ACO2）和脂酰化DLAT（Lip-DLAT）表达下调，这些分子改变与脂酰化代谢受损和铁硫簇生物合成障碍相关，符合铜死亡的分子特征。结论：本研究确定了新生大鼠HIBD后与神经元损伤同时发生的多种铜死亡相关分子改变；这些改变伴随脂酰化修饰受损和氧化还原稳态破坏。
论文解读：新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中的铜死亡相关分子改变
一、研究背景与目的
新生儿缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是由脑血流减少和氧供应不足引起的严重神经系统疾病，是导致新生儿死亡和远期神经功能障碍的主要原因。存活患儿中，5%–10%存在持续性运动缺陷，20%–50%在青少年期仍表现出感觉或认知异常。然而，HIBD的发病机制复杂，临床治疗手段有限，深入探究其潜在机制具有重要意义。铜是正常脑发育所必需的金属离子，其稳态对维持神经元生理活动至关重要。铜进入中枢神经系统依赖血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）和血脑脊液屏障（blood-cerebrospinal fluid barrier，BCB）。脑内铜主要储存于胶质细胞，并通过钙依赖性分泌途径动态释放以满足神经元需求。在神经元内，铜参与细胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）介导的线粒体能量代谢、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）相关的抗氧化防御以及多巴胺β-羟化酶（dopamine β-hydroxylase，DBH）催化的神经递质合成。脑组织代谢活跃且含有大量铜依赖性酶，对铜稳态紊乱尤为敏感。铜死亡（cuproptosis）是一种新发现的由细胞内铜过度积累引起的调节性细胞死亡形式。当铜过载时，铜离子直接干扰线粒体呼吸链中的三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle），触发脂酰化蛋白寡聚化和铁硫簇（iron-sulfur cluster，ISC）蛋白失稳，进而诱导蛋白毒性应激和氧化损伤，最终导致细胞死亡。已有研究表明HIBD患者血清铜水平显著高于健康对照，缺氧可上调高亲和力铜转运蛋白1（copper transporter 1，CTR1）表达，增强细胞铜摄取；缺血诱导的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可破坏铜结合蛋白结构，促进游离铜离子释放。在脑缺血模型中，铜螯合剂四硫代钼酸盐可显著减少梗死体积并增强抗氧化能力。然而，铜死亡在HIBD病理过程中的直接证据仍然缺乏。为此，研究人员建立了新生大鼠HIBD模型，检测铜死亡相关分子的表达并表征细胞死亡表型，旨在初步明确HIBD发病中与铜死亡相关的分子改变。
二、研究内容与主要技术方法
研究人员采用改良Rice–Vannucci法建立新生大鼠HIBD模型。实验动物为7日龄（P7）雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，饲养于中国科学院大学温州研究院动物实验中心无特定病原体（specific pathogen-free，SPF）级动物房。动物实验经机构伦理委员会批准（批准号WIUCAS24010903）。主要技术方法包括：应用激光散斑对比成像（laser speckle contrast imaging，LSCI）动态监测脑血流，评估缺血程度；采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色检测脑梗死体积；通过脑组织含水量测定评估脑水肿程度；利用苏木精–伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色和尼氏（Nissl）染色观察组织病理学改变；采用透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）观察线粒体和内质网等亚细胞结构；使用特异性检测试剂盒测定脑组织中ROS、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）水平和铜离子浓度；通过免疫荧光（immunofluorescence，IF）染色检测胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、离子钙结合适配分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1，IBA-1）、神经元核抗原（neuronal nuclei，NeuN）与二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶（dihydrolipoamide S-acetyltransferase，DLAT）的共表达情况；采用蛋白质印迹法（Western blotting，WB）分析铜死亡相关蛋白表达水平。研究在HIBD建模后24小时检测铜含量、氧化应激指标、Western blot和TEM超微结构，在建模后7天（P14）进行组织学染色和DLAT免疫荧光检测，分别对应HIBD的急性期和亚急性期病理改变。
三、研究结果
1. HIBD模型成功建立
通过LSCI动态监测皮层脑血流，结果显示HIBD组左侧大脑半球血流信号强度显著低于假手术组，且HIBD组左侧较右侧明显降低，而假手术组双侧无显著差异。TTC染色显示假手术组脑片均匀红染，HIBD组左侧皮层出现明显苍白区，定量分析证实损伤侧存在显著脑梗死。脑含水量检测显示HIBD组脑含水量显著升高，大体形态观察可见损伤侧脑组织液化、坏死和萎缩。以上结果确认缺氧缺血损伤严重破坏脑组织完整性，表明新生大鼠HIBD模型建立成功。
2. HIBD诱导脑组织病理改变和神经元损伤
HE染色显示，假手术组大脑皮层和海马各区组织结构完整、细胞排列有序；HIBD组大脑皮层组织明显增宽疏松，海马CA1、CA3区细胞排列紊乱，齿状回（dentate gyrus，DG）出现明显细胞丢失。Nissl染色显示HIBD组皮层和海马亚区尼氏体信号减少，提示神经元合成功能受损。TEM观察发现，假手术组神经元线粒体形态规则、嵴清晰；HIBD组线粒体弥漫性肿胀、嵴断裂溶解，内质网严重扩张呈空泡状，提示亚细胞结构显著损伤。这些结果表明缺氧缺血可导致多个脑区神经元损伤。
3. HIBD诱导氧化应激增强和铜离子积累
特异性检测试剂盒检测结果显示，与假手术组相比，HIBD组缺血脑组织中ROS水平显著升高，GSH和GPX4水平显著降低，表明HIBD导致脑组织氧化应激水平升高和抗氧化防御能力受损。铜离子比色法检测显示，HIBD组缺血脑组织铜离子含量显著高于假手术组，说明缺氧缺血损伤可引起脑组织铜离子异常积累。这些结果共同提示新生大鼠HIBD期间存在明显的氧化应激和铜离子代谢失衡。
4. HIBD后不同神经细胞类型中DLAT的表达特征
免疫荧光双重染色分析IBA-1（小胶质细胞标志物）、GFAP（星形胶质细胞标志物）、NeuN（神经元标志物）与DLAT在左侧大脑皮层的共表达情况。结果显示，HIBD组IBA-1和GFAP荧光强度增加，提示小胶质细胞和星形胶质细胞活化增殖；NeuN荧光信号减弱，表明神经元丢失或损伤。DLAT表达在HIBD组普遍低于假手术组，且其下调趋势与NeuN信号减少相关。在IBA-1或GFAP信号增强的区域，共定位的DLAT信号也呈下降趋势，提示DLAT下调可能发生于多种细胞群体。
5. HIBD后铜死亡相关标志物表达水平改变
Western blot结果显示，与假手术组相比，HIBD组铜死亡上游调节因子铁氧还蛋白1（ferredoxin 1，FDX1）蛋白表达显著上调，应激保护分子热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）表达增加，可能反映细胞对铜过载损伤的代偿性反应。参与线粒体代谢和脂酰化修饰的蛋白表达呈下降趋势：硫辛酸合成酶（lipoyl synthase，LIAS）表达降低可能提示脂酰化修饰受损和线粒体呼吸链功能障碍；脂酰化DLAT（lipoylated dihydrolipoamide transacetylase，Lip-DLAT）表达减少表明线粒体代谢通路受抑可能加剧铜死亡进程；线粒体乌头酸酶2（aconitase 2，ACO2）显著下调与铜代谢失衡引起的线粒体破坏相关。这些发现表明HIBD后脑组织中铜死亡相关蛋白表达谱发生显著重塑，该异常表达模式可能是铜离子积累诱导神经元死亡的重要分子机制。
四、讨论与结论
研究人员在讨论部分指出，HIBD组观察到的线粒体肿胀、嵴结构减少或消失以及内质网扩张等超微结构改变，不同于凋亡、坏死和自噬的典型形态学特征，而更类似于铜死亡样改变。铜过载可抑制线粒体呼吸链复合物活性，破坏线粒体电子传递链的位点特异性，导致线粒体功能障碍，这是铜死亡的核心特征之一。本研究中铜离子和ROS水平升高、GSH和GPX4水平降低，表明氧化应激失衡与铜相关分子扰动并存。GSH作为铜伴侣可直接结合过量亚铜离子形成复合物并排出细胞，同时也是GPX4的重要辅酶参与清除ROS和脂质过氧化物。铜螯合剂治疗可增加GSH水平、增强抗氧化酶活性并减轻铜过载损伤。DLAT作为铜死亡通路的关键靶点，其下调与神经元标志物减少趋势平行，提示DLAT功能障碍可能参与HIBD后神经元损伤。研究还观察到FDX1和HSP70上调，LIAS、ACO2和Lip-DLAT下调，其中LIAS和ACO2为铁硫簇蛋白，其减少提示铁硫簇生物合成受损。FDX1作为蛋白脂酰化的上游调节因子和铜死亡的关键调控因子，其增加可能促进铜在线粒体中的再分布和激活。Lip-DLAT水平降低可能使其由可溶的功能形式转变为不溶性毒性聚集体，进一步加剧铜死亡。研究结论指出，该研究在新生大鼠HIBD模型中鉴定出多种与神经元损伤同时发生的铜死亡相关分子和超微结构特征。其潜在机制为：HIBD破坏脑铜离子稳态和线粒体功能，导致氧化应激失衡和异常脂酰化，可能为神经元特异性铜死亡样分子事件提供条件并促进神经损伤。研究还存在局限性：未使用铜螯合或基因操作等功能干预手段，无法确认铜死亡在HIBD中的因果作用；仅检测了总脑铜浓度，未评估线粒体或胞质不稳定铜；未系统分析DLST等其他关键靶点；且不能排除铁死亡等其他调节性细胞死亡途径的并存。这些局限为未来研究提供了方向，以靶向铜死亡相关通路作为HIBD潜在治疗策略仍需进一步功能验证。
