联合靶向RNA与DNA的CRISPR核糖核蛋白增强对HBV转录本的抑制效果

《Frontiers in Genome Editing》：Combined RNA- and DNA-targeting CRISPR ribonucleoproteins enhance suppression of HBV transcripts

　　

摘要 引言：慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染仍然是一个重大的全球健康问题，目前尚无根治性治疗方法。靶向RNA的CRISPR系统提供了一种潜在的替代DNA编辑核酸酶的方案，能够在不引入基因组断裂的情况下直接降解病毒转录本。在本报告中，研究人员评估了靶向HBV RNA的合成指导RNA（guide RNA，gRNA）/Cas13d核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）的抗病毒活性，及其与靶向DNA的RNP联合使用的效果。 方法：研究人员设计了10条针对HBV转录组保守区域的gRNA，随后筛选出Cas13d的最佳候选gRNA。为了增强抗病毒效力，研究人员评估了使用组合gRNA6+gRNA7/Cas13d RNP的多重RNA靶向策略，以及将靶向RNA的gRNA7/Cas13d与先前已验证的靶向HBV DNA的gRNA9/Cas9和gRNA4/Cas12a RNP联合用于HBV治疗的效果。 结果：在这10条gRNA中，gRNA7/Cas13d表现出对其特定靶标RNA转录本的选择性敲低，而未诱导总HBV DNA、mRNA和蛋白质的广泛抑制。gRNA7/Cas13d RNP的抗病毒效应是短暂的，在处理后第3天即减弱。与单条gRNA相比，组合gRNA6+gRNA7/Cas13d处理也未能进一步诱导全局性的HBV抑制，尽管在HBV细胞模型中，gRNA7/Cas13d在联合处理期间仍显示出稳健的靶标特异性RNA切割。虽然gRNA9/Cas9和gRNA4/Cas12a单独或联合使用时均表现出主导性的抗病毒效应，导致HBV复制和表达显著降低，但加入gRNA7/Cas13d进一步增强了对gRNA7特异性HBV RNA转录本的抑制，实现了目标RNA水平高达80%的降低。 讨论：总体而言，这些发现表明，gRNA7/Cas13d能够介导靶标特异性的HBV RNA切割，但作为单一药物单独使用时整体抗病毒活性有限；然而，靶向DNA和靶向RNA的CRISPR-RNP联合使用可能为增强靶标特异性的HBV RNA抑制提供一种互补策略。

研究背景与意义

慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球性的重大公共卫生挑战，影响超过2.5亿人，是导致肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的主要原因。当前抗病毒疗法如核苷（酸）类似物（nucleos(t)ide analogs，NAs）和干扰素-α虽能有效抑制病毒复制，但难以实现病毒完全清除，根本原因在于感染肝细胞核内共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的持续存在。cccDNA作为所有病毒RNA（包括前基因组RNA，pregenomic RNA，pgRNA）的转录模板，其持久性是实现HBV根除的主要障碍。因此，开发能够永久消除或沉默感染细胞内HBV遗传物质的新策略，是亟待满足的医疗需求。

近年来，基于RNA引导的RNA靶向CRISPR系统为破坏病毒基因组提供了新思路。与广泛使用的靶向DNA的Cas9和Cas12系统相比，它们虽能切割整合的病毒DNA，但引入双链断裂的机制引发了关于脱靶诱变、染色体易位和基因组不稳定性的严重安全担忧。而RNA靶向的CRISPR效应器Cas13d（又称RfxCas13d或CasRx）提供了一种可编程的RNA切割途径，能在不直接修饰宿主DNA的情况下降解病毒RNA转录本。Cas13d是一种紧凑的VI-D型CRISPR-Cas效应器（约930个氨基酸），利用单链指导RNA（guide RNA，gRNA）直接结合并切割单链RNA（single-stranded RNA，ssRNA），无需原型间隔区邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）或原型间隔区侧翼序列（protospacer flanking sequence，PFS），可通过RNA、mRNA、病毒载体等多种方式递送。此前研究已证明Cas13d在SARS-CoV-2、亨廷顿病等模型中具有高效性和高特异性。

研究人员此前已报道过使用合成的gRNA/Cas9和gRNA/Cas12a RNP切割HBV DNA以实现病毒抑制的研究。在此基础上，本研究旨在探索将RNA靶向的Cas13d系统应用于HBV，并评估其与DNA靶向CRISPR系统联合使用的潜力，以期实现更有效的病毒抑制。

主要技术方法

1. 1.
   gRNA设计与合成：利用在线CRISPR设计工具CHOPCHOP分析HBV ayw毒株基因组，鉴定出10条靶向HBV聚合酶（P）、衣壳（C）、表面抗原（S）和X基因保守区的独特gRNA，并由Integrated DNA Technologies（IDT）合成。
2. 2.
   RNP复合物组装与细胞核转染：分别将gRNA与Cas13d、Cas9或Cas12a蛋白孵育形成RNP复合物。使用SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit和4D核转染仪，将RNP导入HepG2.2.15和HepDE19两种HBV持续性感染细胞模型中。
3. 3.
   定量检测：采用实时荧光定量PCR（real-time qPCR）检测HBV mRNA、pgRNA、DNA及特定gRNA靶区域RNA水平；采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测细胞上清液中乙型肝炎e抗原（HBeAg）和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）水平。
4. 4.
   脱靶分析：通过计算机模拟预测Cas9和Cas12a gRNA的潜在脱靶位点，并使用靶向rhAmpSeq测序进行评估。

研究结果

设计Cas13d特异性gRNA靶向HBV转录组

研究人员利用CHOPCHOP工具设计了10条针对HBV基因组保守区的Cas13d gRNA，并针对人类转录组进行了筛选以确保最小脱靶互补性。每条gRNA包含一个5'端的保守直接重复序列（direct repeat，DR）和一个27-28 nt的HBV特异性间隔序列。其中，gRNA1至gRNA10分别与研究人员此前发表的Cas9或Cas12a gRNA靶向位点相对应，便于比较RNA靶向与DNA靶向CRISPR系统的活性。

在HepG2.2.15细胞中测试gRNA/Cas13d RNP候选物的抗病毒活性

在持续产生HBV的HepG2.2.15细胞模型中，于核转染后24小时评估各gRNA/Cas13d RNP的活性。结果显示，与对照gRNAc/Cas13d相比，所有靶向HBV的gRNA/Cas13d RNP处理后，总HBV mRNA、pgRNA、HBsAg和HBeAg水平均无显著差异。然而，使用靶向各gRNA位点的特异性引物进行RT-qPCR分析发现，gRNA6、gRNA7和gRNA8均能显著降低其各自靶位点的mRNA水平，表明Cas13d介导了序列特异性的RNA切割。其中，gRNA7因抑制效率更高且稳定性更好而被选用于后续实验。

评估gRNA7/Cas13d RNP在HepG2.2.15细胞中的时间依赖性抗病毒活性

为评估时间效应，研究人员在第1、3、6天监测了HBV标志物。结果表明，与对照组相比，gRNA7/Cas13d处理在任何时间点均未改变总HBV mRNA、pgRNA、DNA及分泌的HBsAg和HBeAg水平。但在第1天，gRNA7靶区域的RNA水平出现显著降低，表明发生了瞬时性的RNA切割。然而，这种降低随时间逐渐消失，到第3天和第6天已无显著差异，说明gRNA7/Cas13d的抗病毒活性是靶标特异性且短暂的。

在持续性HBV细胞模型中评估双重gRNA Cas13d介导的RNA靶向

为进一步探究多重RNA靶向能否增强抗病毒效果，研究人员在HepG2.2.15和HepDE19细胞中评估了gRNA6/Cas13d与gRNA7/Cas13d联合处理的效果。在两种细胞系中，无论是单条还是联合gRNA处理，均未显著降低总HBV mRNA、pgRNA、HBsAg或HBeAg水平。靶区域分析显示，gRNA6单处理可降低其自身靶区域RNA，但此效应在联合处理中未维持；而gRNA7单处理及联合处理均能显著降低gRNA7靶区域的RNA水平。这表明gRNA7活性更强且更稳定，但双重gRNA靶向并未带来额外的全局性抗病毒增益。

通过gRNA9/Cas9、gRNA4/Cas12a和gRNA7/Cas13d RNP的三重联合处理增强抗病毒活性

基于此前发现gRNA9/Cas9与gRNA4/Cas12a联合具有增强抗病毒活性的结果，研究人员进一步评估了加入RNA靶向CRISPR系统的效果。在HepG2.2.15和HepDE19细胞中，先用gRNA4/Cas12a和gRNA9/Cas9处理2-3天，再核转染gRNA7/Cas13d处理1天。结果显示，在两种细胞中，单独的gRNA9/Cas9或gRNA4/Cas12a或其组合均能显著降低HBV mRNA、pgRNA、DNA及抗原水平，而单独的gRNA7/Cas13d则无此效果。但是，在经DNA靶向CRISPR预处理的细胞中，gRNA7/Cas13d能显著降低其靶区域的RNA水平。三重联合处理效果最为显著，在HepG2.2.15细胞中实现了约80%的目标RNA转录本降低，在HepDE19细胞中更是达到了约92%的降低。这表明，虽然Cas13d单独作用有限，但与DNA靶向CRISPR联合使用时，能有效增强对特定HBV RNA转录本的抑制。

有限的脱靶编辑

通过对Cas9和Cas12a gRNA预测脱靶位点进行靶向rhAmpSeq测序评估，大多数分析位点的未编辑读段比例超过95%，表明在大多数评估位点上的编辑非常有限，支持了本研究所用gRNA具有相对良好的特异性。

讨论与结论

本研究证明了利用RNA靶向CRISPR-Cas13d系统特异性降解HBV RNA转录本的可行性，并探索了其与DNA靶向核酸酶整合以增强靶标特异性抗病毒效果的策略。结果显示，gRNA7/Cas13d能介导其靶标RNA的切割，但这种RNA降解是短暂且不足以显著影响整体HBV DNA、RNA和蛋白质水平的，这突显了当前在递送效率、Cas13d RNP胞内稳定性及靶标可及性方面的局限性。研究结果与此前Cas13d对SARS-CoV-2等高表达病毒靶标的强效抑制形成对比，提示HBV紧凑且重叠的转录组可能限制了有效靶点的选择，同时由cccDNA持续产生的高丰度、高稳定性转录本也可能压倒了瞬时的RNA切割活性。

值得注意的是，三重联合处理所观察到的增强抗病毒效果支持了一个多层次CRISPR靶向模型：gRNA9/Cas9和gRNA4/Cas12a在细胞核内破坏HBV DNA，减少cccDNA及整合DNA的转录；而gRNA7/Cas13d则在细胞质中补充了一层干预，直接降解特定的HBV RNA转录本。这种联合策略靶向了病毒生命周期的多个阶段，为限制病毒总产量提供了一个概念框架。然而，将这种CRISPR组合策略临床转化仍面临诸多挑战，包括将多个大型RNP递送至肝细胞、潜在的免疫原性以及对宿主基因组或RNA转录本的脱靶切割。未来的研究需优化gRNA设计、增加RNP剂量，并结合高效的递送系统（如脂质纳米颗粒lipid nanoparticles，LNPs或腺相关病毒载体Adeno-Associated Virus，AAV）及多次重复或序贯治疗方案，以期实现更持久和彻底的HBV抑制。

研究结论总结：研究结果证明，Cas13d能够实现序列特异性的HBV RNA切割，但单独使用时抗病毒活性有限。在联合治疗中，主要的抗病毒效应由DNA靶向系统（Cas9和Cas12a RNP）介导，而Cas13d主要贡献于额外的靶向RNA敲低，并未实质性增强整体抗病毒效力。这些发现表明，多重CRISPR-RNP策略可能有助于未来实现功能性且持久的HBV治愈。