菌丝体复合材料在线监测的闭环托盘生物反应器

《Frontiers in Microbiology》：A closed-loop tray bioreactor for online monitoring of mycelium-based composites

　　

摘要翻译：菌丝体复合材料（Mycelium-based Composites, MBCs）是在固态发酵（Solid-State Fermentation, SSF）条件下，通过丝状真菌在木质纤维素基质中生长而制备的生物衍生结构材料。固态发酵过程难以控制，因为真菌生长对温度、湿度和气体组分的局部梯度高度敏感。本研究介绍了一种用于菌丝体复合材料受控培养的模块化托盘生物反应器的设计、构建与实验验证。该系统将温度和相对湿度的闭环反馈控制与二氧化碳和氧气连续监测、二氧化碳演化速率（Carbon dioxide Evolution Rate, CER）在线计算、可编程环境轨迹以及通过主从架构实现的多单元同步运行相结合。系统性能在两次非生物实验和两次生物实验中进行了评估。在非生物条件下，反应器在约26–29°C和25%–50%相对湿度的实际运行范围内提供了稳定调控，在设定点处的稳态温度误差低于0.5°C，在固定设定点运行期间均方根误差（Root Mean Square Error, RMSE）为0.12°C。在使用木蹄层孔菌（Ganoderma sessile）的生物实验中，环境调控保持相近水平，而二氧化碳积累和二氧化碳演化速率清晰地区分了生物活性与非生物基线，并分辨出菌体在闭合模具内内部生长与脱模后外部生长之间的转变。两次生物运行（一次动态轨迹，一次恒定轨迹，未设置生物学重复）仅作为平台的概念验证演示，而非生长动力学的定量研究；运行包络以及电化学氧传感器用于摄氧率（Oxygen Uptake Rate, OUR）和呼吸商（Respiratory Quotient, RQ）分析时的有限分辨率被报告为当前的硬件限制。该平台还被部署为跨不同尺寸腔室的四单元同步阵列。综合这些结果，本研究建立了一个可重复的实验平台，用于菌丝体复合材料的受控发酵，并为未来将环境调控与生长动力学及材料性能联系起来的研究奠定基础。

论文解读：菌丝体复合材料（Mycelium-based Composites, MBCs）是由丝状真菌在固态发酵（Solid-State Fermentation, SSF）条件下穿透木质纤维素基质而形成的生物衍生结构材料。随着菌落发育，富含几丁质的菌丝网络形成三维自粘结结构，将基质颗粒粘合在一起，从而在发酵过程中通过模具约束生长成精确且复杂的几何形状。该材料兼具低堆积密度（通常为50–200 kg m?3）、足够的压缩和弯曲强度、竞争性的热绝缘性能以及在堆肥条件下数周内完全好氧生物降解等特性，因而被视为发泡聚苯乙烯和聚氨酯泡沫的潜在替代品。然而，从实验室方案走向可靠的工业规模生产仍面临重大挑战，其中气候受控发酵环境的设计与固态发酵动力学的理解被认为是主要限制因素。固态发酵的工程核心难点在于其过程本质上是固态的，缺乏自由水，从而消除了液相生物过程中使过程可控的对流混合和散热机制。真菌生物质在活跃定植过程中产生大量代谢热（估计为每公斤干基质40–120 W），这些热量在基质内部积累并产生温度、氧气和二氧化碳浓度的陡峭空间梯度。这些梯度直接导致不均匀定植：基质外围区域过度通气并迅速干燥，而内部区域变得缺氧和热应激。由于最终复合材料的机械性能取决于菌丝网络的空间密度和连续性，不受控的固态发酵会产生密度不均、力学性能各向异性和高批次间差异的产品，无法满足质量保证制造的要求。托盘生物反应器是工业规模生产菌丝体复合材料的自然选择，因为无机械搅拌可保护发育中的菌丝支架的结构完整性。强制空气对流显著改善了静态操作下的传热和传质，但引入了关键的多变量耦合问题：增大气流同时降低CO?分压、加速基质表面水分蒸发损失并增加O?供应，而这三者都直接影响真菌生长动力学，从而直接影响代谢热产生速率。研究表明，高通风速率下即使配备自动湿度控制，仍会因逐渐干燥而对产量产生净负面影响，证实气流和湿度无法独立调节。进气温湿度调节还受饱和蒸汽压变化的影响，进一步增加了控制复杂度。这些相互依赖关系意味着单输入单输出控制策略会产生持续的交叉变量干扰，需要多输入多输出（Multiple-Input Multiple-Output, MIMO）硬件和控制系统才能实现对耦合多变量生物过程的充分调控。在菌丝体复合材料领域，生产几乎完全在静态托盘或开放式模具培养箱中进行，已有的最接近方案仅规定了密封外壳内被动CO?积累的目标，而不具备主动传感器驱动的反馈或扰动抑制能力。不受控的环境偏差对菌丝体复合材料生产尤其严重，因为由此造成的损害是不可逆的且空间局部化：超温触发产孢并永久影响该区域的定植；CO?积累超过抑制阈值会降低菌丝分枝密度、削弱最终材料的力学各向同性；基质干燥降至临界水分活度阈值以下会不可逆地停止该区域的菌丝延伸。由于复合材料的力学性能由菌丝网络在整个基质体积中的空间连续性决定，任何局部环境偏差都会产生无法修复的永久性材料缺陷。目前尚无已发表的菌丝体复合材料研究实现对所有主要固态发酵过程变量的同步闭环控制。为此，研究人员设计、构建并实验验证了一种用于菌丝体复合材料固态发酵的模块化闭环托盘生物反应器。该系统提供温度和相对湿度的独立比例-积分-微分（Proportional-Integral-Derivative, PID）反馈控制、基于预表征风扇转速校准的开环气流调节，以及用于实时呼吸测量法估算真菌活性的CO?和O?连续监测。仪器化顶盖与反应器外壳物理解耦，使同一控制组件可部署在不同尺寸的腔室上；本研究评估了两种标准玻璃外壳：1,000 × 500 × 500 mm（长 × 宽 × 高）和1,000 × 1,000 × 500 mm（长 × 宽 × 高）。平台还支持自定义时变环境剖面和通过TCP/IP主从单元同步实现的多单元操作。该工作的主要贡献是为菌丝体复合材料固态发酵建立一个可重复的实验平台，能够在精确定义和主动调控的环境条件下系统研究过程-结构-性能关系。

研究人员开展的研究包括：反应器的硬件设计由仪器化顶盖、可互换外壳和独立控制单元三部分组成。顶盖集成了所有传感器、空气循环风扇、加湿硬件和3D打印风道组件，通过气密密封安装在外壳上。内部空气由顶盖上的风扇再循环，所有三个空气接口（再循环供气入口、新鲜空气交换入口和排气出口）均安装HEPA过滤器以提供生物密封。进气温度通过集成在顶盖气流回路中的100 W 12 V正温度系数（Positive-Temperature-Coefficient, PTC）加热器调节，加热器功率在闭环温度反馈下通过脉宽调制（Pulse-Width-Modulation, PWM）连续调节。加湿通过加压水箱供水的超声波雾化喷嘴实现，由电磁阀控制输送。新鲜空气以操作员定义的交换速率（每小时换气次数）进入，该速率决定稳态CO?浓度；排气被引导至CO?/O?分析仪进行呼吸测量。两个传感器组件安装在仪器化顶盖下表面的两端：一个组件包含DFRobot Gravity电化学氧传感器（0%–25% vol., I2C），提供O?浓度和局部腔室温度的连续原位测量；另一个组件包含Seeed Studio SCD30模块（Sensirion SCD30, I2C），通过非色散红外吸收测量CO?、电容传感测量相对湿度以及温度。将温度传感器置于外壳两端可检测活跃定植期间基质表面的空间梯度。控制系统的硬件架构基于Seeed Studio reTerminal（含Raspberry Pi Compute Module 4, CM4），运行Raspberry Pi OS，负责传感器轮询、反馈控制、数据记录和操作员交互。两个独立的PID控制回路并行连续运行：温度控制器使用两个腔室内温度测量的平均值通过脉宽调制调节PTC加热器；湿度控制器使用SCD30相对湿度测量值驱动加湿电磁阀。气流通过预表征的风扇转速-流量校准开环调节，新鲜空气交换由操作员设定以确定总体气体交换速率。软件界面使用LVGL (v8)在reTerminal触摸屏上本地渲染，并通过局域网上的Web界面提供远程访问。软件还支持通过TCP/IP主从单元同步实现多单元操作，主单元向连接的从单元广播设定点、经过时间和配方阶段。在呼吸测量方面，腔室顶部空间被视为连续搅拌釜反应器（Continuously Stirred Tank Reactor, CSTR），内部再循环不产生净气体添加或去除，唯一与外界的气体交换通过新鲜空气入口以体积流量F?发生。在此条件下，按干基质质量归一化的CO?演化速率（Carbon dioxide Evolution Rate, CER）和O?摄取速率（Oxygen Uptake Rate, OUR）分别由公式（1）和（2）计算，呼吸商（Respiratory Quotient, RQ）定义为CER与OUR之比如公式（3）所示。本研究中，CER是唯一基于有效实时数据计算并用于定量解释的呼吸测量参数；由于电化学O?电池的0.1% vol.量化步长超过了当前操作条件下观察到的代谢O?消耗量，OUR和RQ无法可靠分辨，仅以原始轨迹形式报告。基于OUR估算瞬时比生长速率（μ）需要菌株特异性生物量-氧产率系数（Y_O?）和生物量浓度（X）的估计值，因木蹄层孔菌尚无固态发酵条件下的Y_O?报道，该框架留待未来工作。生物材料方面，使用的真菌菌株为木蹄层孔菌（Ganoderma sessile），通过组织培养从新鲜子实体中分离，保存在麦芽提取物琼脂上。该物种被选为代表性菌株，因其用于包括Ecovative和Mogu等公司的商业菌丝体材料生产。谷粒菌种在无菌小米上制备，以16%（w/w）比例（相对于基质干重）作为接种物。基质由最大粒径4 mm的大麻杆芯（hemp shives）组成，补充麦麸[5%（w/w）]作为额外碳氮源和石膏[1%（w/w）]作为pH缓冲剂和结构调节剂。基质含水量在灭菌前调节至62%（w/w）。所有基质批次在121°C、103 kPa下高压灭菌15分钟，灭菌后在无菌条件下冷却至室温再接种。接种后的基质转移至聚丙烯袋中，在约26°C和60%相对湿度下预培养5天，使初始定植完成后再转移至生物反应器。材料形成方案由两个连续阶段组成，以模具状态区分：内部生长（闭合模具）阶段，接种基质被限制在定制聚丙烯（Polypropylene, PP）真空成型托盘内、置于仪器化顶盖下方；2.8天后，固结的部件从模具中取出但仍保留在同一仪器化腔室内，暴露先前受限的表面至腔室顶部空间，启动外部生长（暴露）阶段，真菌在暴露表面形成更致密、连续的菌丝表皮。实验设计方面，控制器性能通过四次实验评估：两次无生物材料的非生物运行，随后两次使用接种基质进行的生物运行。第一次非生物实验为48小时多步温湿度方案，包含近似昼夜节律的连续设定点变化，随后是高温低湿的终末应激段。第二次非生物实验为固定在25°C和45% RH的恒定设定点运行。两次生物实验遵循相同的比较逻辑：第一次生物运行采用从非生物方案延伸而来的多步昼夜节律加应激方案，覆盖4.5天过程（多步运行）；第二次生物运行在可用记录窗口内维持25°C和45% RH恒定条件（固定设定点运行）。

关键技术方法方面，研究人员主要采用了以下技术：（1）模块化硬件架构，将仪器化顶盖（集成传感器、风扇、加湿装置和PTC加热器）与可互换外壳解耦，使同一控制组件可适配不同尺寸腔室；（2）基于双PID控制回路的闭环环境调控，分别对温度和相对湿度进行反馈控制，辅以基于预校准风扇曲线的开环气流调节和操作员设定的新鲜空气交换率；（3）基于顶空间气体质量平衡的实时呼吸测量法，利用连续监测的CO?和O?浓度按连续搅拌釜反应器模型计算CER；（4）主从同步架构，通过TCP/IP协议在主单元与从单元之间广播设定点、过程时间和配方阶段，实现多反应器协调运行。非生物和生物实验中均使用木蹄层孔菌作为测试菌株，基质为大麻杆芯补充麦麸和石膏，两种外壳尺寸为1,000 × 500 × 500 mm和1,000 × 1,000 × 500 mm。

研究结果分为三个部分：

**非生物控制器验证**：在无生物材料条件下，控制器首先被评估以建立性能基线。两次实验结果表明，在多步运行中，反馈温度传感器T2在设定点位于26.5°C–28.0°C可控制范围内时准确跟踪程序化轨迹，稳态误差保持在0.5°C以下，均方根误差（Root Mean Square Error, RMSE）范围为0.13–0.46°C，稳定间隔内标准差为0.03–0.07°C，每个新设定点的重新建立约需30分钟。在固定设定点运行中，T2稳定在24.93°C ± 0.11°C，对应25°C目标，稳态误差为?0.08°C，RMSE为0.12°C。当设定温度低于约26°C时，T2保持在设定点上方1.4–2.7°C，表明当前硬件配置下存在下限。相对湿度在设定点RH ≤ 40%时跟踪误差低，RMSE值为0.24%–0.80% RH，标准差低于1.3% RH；但更高设定点（≥51%）时RH稳定在目标下方11%–16%，达到约47%–50% RH的实际上限。在固定设定点45% RH目标下，控制器稳定在46.19% ± 1.64% RH，RMSE为2.03%。在终末应激段，设定为30°C和25% RH，T2在48小时结束时仅达到28.7°C，稳态误差为?1.3°C，而RH保持在29.0% ± 0.12%。整个过程中，顶空CO?和O?均接近大气值：多步运行中CO?在365–415 ppm之间波动，O?保持在20.2%–20.7%（v/v）；固定设定点运行中CO?从初始约470 ppm在约2小时内降至383 ± 5 ppm后保持稳定。O?信号存在约0.5%的系统性偏低偏移。总体而言，非生物实验确定了反应器在当前气流配置下的可操作范围约为26°C–29°C和25%–50% RH。

**生物控制器验证与在线生长监测**：在活体发酵条件下，环境调控与非生物条件下相当。多步运行中，T2在整个4.5天培养期内跟随程序化温度分布，并呈现与前述相同的运行极限：低于约26°C的设定点保持在目标上方，终末高温段低于上限。固定设定点运行中，T2在可用记录窗口内稳定在25.6°C ± 0.08°C。相对湿度在两次运行中在设定点≤40%时均紧密跟踪方案，而多步剖面中的较高设定点再次接近上限。生物活性通过CER明确区分。多步运行中，CER从第一小时的1.9 mmol kg?1 h?1上升至约0.7天时的峰值3.32 mmol kg?1 h?1，随后在内部阶段逐渐下降至开模时（2.8天）约2.4 mmol kg?1 h?1。脱模在t = 2.8天处产生约0.5 mmol kg?1 h?1的CER瞬时下降，并伴随顶空CO?的同步阶跃，之后CER在外部阶段稳定在1.6–1.9 mmol kg?1 h?1之间。固定设定点运行中，CER从0.4更缓慢地上升至约2.5天时的峰值1.57 mmol kg?1 h?1，随后在内部阶段持续下降，外部阶段保持在0.7 mmol kg?1 h?1以下。阶段平均CER在多步运行中内部生长期为2.58 mmol kg?1 h?1、外部生长期为1.68 mmol kg?1 h?1，而在固定设定点运行中分别为0.95和0.92 mmol kg?1 h?1。顶空CO?在多步运行中达到1,049 ppm，在固定设定点运行中达到706 ppm，均明显高于非生物基线。该平台能在线检测材料形成过程中的生物学关键转变。

**多单元同步**：反应器平台以四单元阵列形式部署，一个主单元通过TCP/IP向三个从单元分配设定点、过程时间和配方阶段信息，而每个反应器保留本地传感、驱动和反馈控制。该阵列组合了两个较大外壳（1,000 × 1,000 × 500 mm）和两个较小外壳（1,000 × 500 × 500 mm），在单个协调系统内跨不同尺寸腔室应用相同控制概念。该阵列级实施证明了用于重复实验和未来放大研究的并行化同步培养的可行性。

讨论部分指出，当前系统的主要限制在于硬件能力而非控制逻辑不稳定性：可达到的温度范围下限（约26°C）和湿度上限（约47–50% RH）受硬件冷却和加湿能力约束。气体解释方面的限制是电化学O?传感器的0.1% vol.量化步长超过了当前发酵条件下观察到的代谢O?消耗，无法支持可靠的OUR和RQ定量分析；此外CER未用独立参考气体分析仪进行交叉验证，因此反映的是校准SCD30信号和开环气流校准而非验证过的绝对速率。将μ估算框架、独立CER验证和O?传感器升级列为未来工作。多单元架构为实现更高通量和改进实验可比性的重复和同步研究提供了途径。研究结论指出：该平台在非生物和生物条件下均能对温度和相对湿度提供稳定的闭环调控，可在约26–29°C和25–50% RH范围内保持控制；顶空CO?和CER能够在线区分生物活性与非生物基线，并分辨菌体从闭合模具内生长到脱模后外部生长的转变；四单元阵列操作证明了控制概念可扩展到协调多反应器运行。该平台为从经验性管理的培养转向可重复、可扩展的菌丝体复合材料生物过程控制奠定了基础。