《Frontiers in Sustainable Food Systems》：Identifying drought-responsive candidate genes in root and shoot tissues of wheat (Triticum aestivum L.) through RNA sequencing, cluster analysis, weighted gene co-expression network analysis, and machine learning models
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干旱胁迫严重影响小麦的生长、发育及产量形成。然而，小麦根与 shoot 组织在干旱适应过程中的分化调控机制仍有待进一步分析。因此，本研究利用来自多个小麦品种的根和 shoot 组织RNA-seq数据集，结合差异表达分析、基因本体（Gene Ontology,
干旱胁迫严重影响小麦的生长、发育及产量形成。然而，小麦根与 shoot 组织在干旱适应过程中的分化调控机制仍有待进一步分析。因此，本研究利用来自多个小麦品种的根和 shoot 组织RNA-seq数据集，结合差异表达分析、基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析、聚类分析、加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）以及机器学习方法，对干旱响应的转录变化进行了表征。差异表达分析在DS1和DS2处理下分别于根中鉴定出90个和3,991个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），而在 shoot 组织中则分别鉴定出34个和1,940个DEGs。功能富集分析表明，根中DEGs主要涉及根系生长、细胞壁重塑、水分运输和渗透调节过程，而 shoot 中DEGs则主要富集于气孔调控、光合作用、脂质代谢和氧化应激响应相关过程。WGCNA在根和 shoot 组织中分别鉴定出18个和19个共表达模块，其中黄色模块与根和 shoot 组织对干旱胁迫的响应显著相关。为进一步从这些模块中筛选干旱响应候选基因，研究人员比较了多种机器学习模型。XGBoost模型在根和 shoot 组织中均取得了最高的AUC。结合SHAP特征贡献分析，分别在根和 shoot 组织中鉴定出30个具有高区分能力的干旱响应候选基因。对候选基因启动子中顺式作用元件的分析揭示了丰富的干旱和胁迫响应元件，包括MYB、G-box、ABRE、MYC、MBS和LTR。其中MYB（根中183个，shoot 中164个）、G-box（168个和98个）和ABRE（148个和86个）尤为丰富，且多个候选基因的启动子中含有超过5个ABRE拷贝，提示其可能参与ABA介导的干旱响应。本研究揭示了小麦根和 shoot 组织在干旱胁迫下不同的转录响应过程，并通过WGCNA结合XGBoost及SHAP分析鉴定了关键共表达模块和核心候选基因。这些发现为理解干旱胁迫下器官特异性分子响应提供了基础，并为提高小麦耐旱性提供了潜在靶点。
干旱胁迫是全球范围内严重影响农业生产的主要非生物胁迫之一。近年来，温室效应加剧和气候变化导致干旱发生频率和持续时间增加，许多作物面临干旱挑战。小麦（Triticum aestivum L.）是全球种植最广泛的粮食作物之一，年产量达7.89亿吨，但小麦对干旱胁迫较其他作物更为敏感，干旱可抑制其生长发育，导致平均产量下降50%至60%。此外，严重水分亏缺会抑制光合作用，破坏渗透平衡和氧化还原稳态，导致活性氧积累、膜损伤和代谢紊乱，显著降低籽粒品质。因此，深入理解小麦干旱响应与适应的调控机制，对鉴定关键抗性基因、指导未来气候条件下稳产高产小麦品种选育具有重要意义。
植物对干旱胁迫的适应是一个涉及多器官协调调控的系统性过程，而非局限于单一组织的局部响应。以往小麦转录组研究通常集中于单一基因型的多个组织，或单一组织在多个基因型间的比较，虽然揭示了关键干旱响应基因和通路，但不同基因型间根和 shoot 组织的协调及器官特异性响应仍未得到充分表征。事实上，植物根系首先感知水分亏缺，随后干旱诱导的生理效应延伸至 shoot 组织，并通过激素信号、水力学信号和代谢物运输建立根与 shoot 间的动态通讯。在此过程中，根和 shoot 具有不同的功能需求：根需优化有限土壤水分的获取，可通过改变根系构型、调整生长方向和增强渗透调节实现；而 shoot 则优先通过气孔关闭和生长抑制来减少蒸腾失水，同时调整光合代谢以缓解电子传递受损、活性氧积累和膜损伤引起的光氧化胁迫。此外，不同植物器官执行物质运输、能量分配和防御响应等不同生理功能，因此各器官对干旱的响应强度、调控途径和基因表达模式可能存在显著差异。单一组织或器官的转录变化可能无法完全反映系统性的生理协调。系统比较根与地上组织间的转录组响应，可鉴定共有的和器官特异性的干旱响应基因，阐明涉及的信号转导、代谢和生理调控过程，对理解小麦不同器官的功能分工和协同调控至关重要。
高通量RNA测序技术的快速发展极大地促进了转录组数据的获取，农业基因组学已从单纯的数据积累转向大规模数据集的深度整合与生物学解读。目前转录组分析通常依赖差异表达谱，研究人员通过严格的倍数变化和统计显著性阈值筛选DEGs，并借助通路富集推断功能。例如，Fu等分析了冬小麦品种济麦418在干旱胁迫下四个发育阶段的转录组，鉴定出数千个DEGs，主要富集于激素信号转导、MAPK信号和碳水化合物代谢；Xi等则在小麦两个品种的根中鉴定出超过11,000个DEGs，GO富集分析显示上调基因主要与干旱及多种非生物刺激响应相关。该方法为分析植物胁迫响应机制提供了重要基础，但基因表达变化广泛且调控过程复杂时，常产生大量候选基因，增加关键基因鉴定和后续功能验证的难度。此外，差异表达分析主要基于单基因在不同处理间平均表达变化的筛选，难以充分反映基因间复杂的协同变化、非线性关系和多基因组合效应，因此一些表达变化较小但具有重要调控作用的基因可能因未达到预设筛选阈值而被忽略。近年来，机器学习方法逐渐应用于高维组学数据的特征筛选和分类预测，为从大规模转录组数据中鉴定关键候选基因提供了新的分析途径。与传统方法相比，基于树的集成学习算法如随机森林（Random Forest, RF）和极端梯度提升（eXtreme Gradient Boosting, XGBoost）能够综合评估多个基因特征对样本分类或表型预测的贡献，并在一定程度上处理变量间的非线性关系和复杂交互作用。通过基因特征重要性排序，机器学习有助于从大量响应基因中进一步缩小候选范围，筛选具有高区分能力和潜在生物学意义的关键基因。然而，机器学习模型的预测结果仍需结合差异表达模式、功能注释、通路富集和生化实验验证进行综合解读，避免将统计预测能力简单等同于生物学调控作用。因此，将传统转录组分析与机器学习特征筛选相结合，有望提高关键干旱响应基因鉴定的准确性和效率，为小麦抗旱育种提供帮助。
本研究系统比较了干旱胁迫下小麦根和 shoot 组织的转录组。通过差异表达分析和GO富集分析，解析了两个器官共有和器官特异性的干旱响应过程。随后进行WGCNA，鉴定与干旱胁迫显著相关的基因模块。进而利用XGBoost模型结合SHAP值评估，分别从根和 shoot 的干旱相关模块中筛选出30个潜在干旱响应候选基因。最后通过启动子顺式作用元件分析，进一步探讨了这些候选基因的潜在转录调控机制。本研究旨在揭示小麦根和 shoot 的差异干旱响应特征，为小麦干旱响应候选基因筛选和功能研究提供有价值的参考和靶点。
研究人员从国家生物信息中心（CNCB）基因组序列归档库（GSA）获取原始RNA-seq数据集（BioProject：PRJCA032349），该数据集涵盖110个小麦品种在充分浇水（WW）、中度干旱胁迫（DS1）和严重干旱胁迫（DS2）条件下的根和 shoot 转录组。剔除测序数据缺失的品种后，保留91个小麦品种共546个样本（根273个，shoot 273个）用于分析。原始 reads 经 FastQC 质控、Trimmomatic 去接头和低质量碱基后，利用 HISAT2 比对至 IWGSC Triticum aestivum v1.0 参考基因组，并用 featureCounts 获得基因水平计数。差异表达分析使用 edgeR 和 limma 包，DEGs 定义为 FDR < 0.05 且 |log2FoldChange| > 0.5。GO 富集分析使用 clusterProfiler 基于 agriGO v2.0 注释文件进行。K-means 聚类分析对 DEGs 的 Z-score 标准化 CPM 值进行聚类。WGCNA 分别对根和 shoot 数据集构建共表达网络，以软阈值 β=3 满足无标度拓扑准则，鉴定出根18个和 shoot 19个共表达模块。机器学习部分，以 log2(CPM+1) 表达值为输入特征，采用嵌套 GroupKFold 交叉验证（以品种为分组因子），比较 XGBoost、RF、DT、GBDT 和 KNN 五种模型区分 WW 和 DS2 样本的性能，基于 AUC 选择 XGBoost，并结合 SHAP 值、置换重要性和交叉折叠特征稳定性整合共识评分，分别在根和 shoot 中筛选出30个核心候选基因。启动子分析提取候选基因 ATG 上游2-kb 区域，利用 PlantCARE 数据库预测顺式作用元件。
研究结果部分：
（1）不同小麦部位干旱胁迫下差异表达基因的鉴定。对546个RNA-seq样本质控和过滤后，保留根中59,869个基因和 shoot 中57,002个基因用于分析。基于前2,000个高变基因的 PCA 显示，根和 shoot 样本沿第一主成分显著分离，表明不同部位间存在显著差异，因此后续下游分析分别对根和 shoot 独立进行。依据预设阈值，根在DS1下鉴定出90个DEGs（57个上调、33个下调），DS2则诱导大规模转录变化，产生3,991个DEGs（1,985个上调、2,006个下调）；其中54个上调基因和26个下调基因在两种干旱强度下共调控。相比之下，shoot 组织响应明显较弱，DS1时仅34个DEGs（20个上调、14个下调），DS2时1,940个DEGs（749个上调、1,191个下调），其中13个基因在两种条件下一致上调和13个一致下调。热图进一步展示了组织特异的表达动态。结果表明小麦在干旱胁迫下发生广泛的转录重编程，且根比 shoot 表现出更高的敏感性和响应性。
（2）差异表达基因的功能富集分析。在根中，DS1主要上调细胞壁重塑过程（如细胞壁松弛和多维生长），同时抑制一般防御反应；DS2加剧了根细胞壁修饰（如木葡聚糖转移酶活性），但广泛下调次生代谢（如木质素生物合成）和凯氏带等结构组分。shoot 组织表现出根本不同的功能轨迹：DS1下上调基因主要涉及囊泡介导运输和糖分配（蔗糖/果糖转运蛋白），而次生代谢物生物合成（如萜类和植物抗毒素）被抑制；DS2下 shoot 虽上调胁迫信号通路（包括乙烯前体ACC响应），但表现出光合机构的大规模协调下调，光系统I和II、捕光复合体和Rubisco活性相关基因被强烈抑制，表明碳固定严重关闭。
（3）干旱胁迫下小麦差异表达基因的聚类分析。根中DEGs形成5个簇（C1–C5），分别包含723、879、389、908和1,102个基因。C1和C2仅在严重干旱（DS2）下显著诱导，表明其在后期胁迫响应中的特化作用；C3在DS1和DS2下均显著上调，表明其高敏感性和早期参与干旱感知；C4和C5在DS2下基因被抑制，其中C4在DS1期间即出现早期下降。GO富集显示C1与类黄酮生物合成正调控相关，C2和C3均富集植物型细胞壁修饰和细胞壁松弛，C4和C5主要涉及木质素生物合成调控和L-亮氨酸分解代谢。shoot 中DEGs同样分为5个时间簇（C1–C5），包含218、538、540、329和323个基因。C1和C2捕获DS2下的上调响应，C1在DS1下早期激活，两者均富集乙烯信号前体（响应1-氨基环丙烷-1-羧酸）和小GTP酶介导的信号转导；C3、C4和C5表征DS2下的下调通路，C5在DS1下即迅速减少，C3和C4主要与光合关闭（Rubisco复合物和光系统I捕光装置抑制）相关，C5与萜烯和S-芳樟醇合酶活性下调密切相关。这些不同的聚类谱凸显了小麦应对渐进干旱胁迫的时空特异性分子策略。
（4）不同小麦组织的加权基因共表达网络分析。对根数据集选择软阈值β=3，满足无标度拓扑拟合指数R2>0.85，分层聚类鉴定出18个共表达模块。模块特征基因与胁迫处理的Pearson相关分析显示，黄色模块与严重干旱（DS2）呈最高正相关（p<0.05），shoot 组织中同样以黄色模块与DS2的相关性最强（p<0.05）。模块特征基因聚类分析显示，根中黄色模块与绿黄色模块紧密聚类，而 shoot 中黄色模块与蓝绿色模块形成紧密层次聚类，表明根和 shoot 在应对严重干旱胁迫时组装了根本不同的共表达架构和模块间调控机制。
（5）利用机器学习预测干旱响应候选基因。五种机器学习算法在根和 shoot 数据集中区分WW和DS2样本的性能评估显示，在根数据集中XGBoost获得最高AUC（0.965），准确率0.907，精确率0.920，召回率0.890，F1分数0.905；残差分析表明XGBoost具有最低的均方根残差，预测性能相对稳定。在 shoot 数据集中，XGBoost同样获得最高AUC（0.964），准确率0.896，F1分数0.896；GBDT表现相当（AUC=0.960），准确率（0.918）和F1分数（0.915）更高。鉴于XGBoost在两种组织中AUC均最高，故选择其进行后续特征优先级分析。整合SHAP重要性、置换重要性和交叉折叠特征稳定性，分别在根和 shoot 中筛选出30个候选基因。其中根候选基因中有28个同时为DS1和DS2下的DEGs，而 shoot 候选基因中仅9个与常规DEGs重叠，其余21个未被鉴定为DEGs。BLASTp搜索拟南芥蛋白组发现，所有30个根候选基因和29个 shoot 候选基因均找到推定同源基因。根中多个候选基因与细胞保护、细胞壁重塑、营养运输和胁迫信号相关，包括LEA蛋白类似基因、扩张蛋白家族、高亲和硝酸盐转运蛋白、III类几丁质酶、MEKK家族激酶相关基因和类malectin受体样激酶同源基因；shoot 中候选基因代表互补的胁迫响应功能，包括CER1相关蜡质生物合成、I型metacaspase、过氧化物酶超家族成员和DnaJ结构域伴侣蛋白。这些结果表明优选的基因涵盖多个可能参与小麦干旱适应的过程，但仍需进一步分子和功能验证。
（6）干旱响应候选基因中顺式作用元件分析。对根和 shoot 各30个候选基因ATG起始密码子上游2-kb区域进行顺式作用元件预测。根候选基因中检测到大量胁迫相关调控元件，MYB元件最为丰富（183个），其次为G-box（168个）、ABRE（148个）、MYC（107个）和STRE（103个）；干旱和脱水相关元件DRE core（43个）和MBS（33个）广泛分布，LTR元件也有检测（10个）。shoot 候选基因中同样呈现相似模式，MYB（164个）、STRE（128个）、MYC（105个）、G-box（98个）和ABRE（86个）丰富，另有DRE core（31个）、MBS（28个）和LTR（21个）。激素响应元件中，MeJA响应的CGTCA-motif和TGACG-motif在根中各65份，在 shoot 中各69份。干旱、胁迫和激素响应顺式作用元件的广泛存在和共现表明，机器学习鉴定的候选基因可能在干旱条件下受多种胁迫响应转录通路调控。
讨论部分总结了小麦不同部位干旱响应差异。从DEGs数量看，根显著多于 shoot，与拟南芥中根比 shoot 具有更多DEGs和更早转录变化的报道一致，反映地下和地上器官基本生理功能的分化：根作为直接接触土壤的器官，优先进行胁迫感知和形态适应；shoot 作为碳同化和蒸腾中心，主要关注水分保存和光保护。功能富集和聚类分析进一步刻画了器官特异性响应策略：根在早期干旱时通过上调细胞壁松弛和多维细胞生长通路主动重塑根构型以优化水分获取，随胁迫加剧转向类黄酮生物合成等次生代谢防御；shoot 则在中度干旱时倾向利用激素信号通路进行预警和胞内信号转导，随后在严重干旱时大规模抑制光合系统以减少光损伤。研究还讨论了机器学习在挖掘干旱响应候选基因中的应用。XGBoost模型分类精度最高，结合SHAP值筛选的核心基因在根和 shoot 间无共享，表明转录响应的强烈组织特异性。值得注意的是，shoot 中30个核心基因有21个被传统DEG筛选遗漏，证明树集成机器学习模型在检测非线性基因互作和捕获经典单变量统计遗漏的核心调控因子方面具有出色能力。基因注释发现根中候选基因包括LEA蛋白类似基因、扩张蛋白家族、蛋白激酶基因等；shoot 中包括CER1蜡质生物合成基因、DnaJ热激蛋白基因、I型metacaspase等，这些基因在已有文献中与干旱和多种非生物胁迫耐受相关。启动子顺式作用元件分析显示ABRE基序在两种组织中高度富集，作为ABA信号核心整合子对激活非生物胁迫抗性网络至关重要，茉莉酸响应元件（CGTCA和TGACG）、MBS（干旱诱导）和LTR（低温和干旱响应）的广泛分布也表明筛选基因可能是重要的干旱响应候选基因。但研究缺乏实验验证仍是局限，未来需结合qRT-PCR和功能实验进一步确认这些候选基因的生物学作用。
研究结论部分：本研究通过整合差异表达分析、WGCNA以及先进的XGBoost和SHAP机器学习框架，系统解析了干旱胁迫下小麦根和 shoot 组织的转录特征。通过功能富集分析和聚类分析，揭示了小麦不同部位DEGs在干旱胁迫下的共有和特异性生物学响应。利用XGBoost算法并结合SHAP特征归因，从WGCNA共表达模块中成功鉴定出具有高区分能力的核心干旱响应候选基因，有效缩小了后续研究范围。顺式作用元件分析进一步表明，这些候选基因包含多个干旱、脱落酸及其他胁迫响应元件，提示其可能参与不同小麦器官中干旱响应的调控。总体而言，本研究建立的整合分析框架提高了干旱响应基因筛选的效率和结果的可解释性，加深了对小麦根和 shoot 差异干旱响应机制的理解，为小麦干旱响应候选基因的功能验证和抗旱品种遗传改良提供了理论基础和候选资源。
