脉冲暴露于环境相关浓度的6PPD-Q会引发虹鳟鱼浓度依赖性的延迟死亡和持续性行为障碍

《Environmental Science & Technology Letters》：Pulsed Exposure to Environmentally Relevant Concentrations of 6PPD-Q Elicits Concentration-Dependent Delayed Mortality and Prolonged Behavioral Impairment in Rainbow Trout

　　

打开图形查看器
摘要
轮胎橡胶转化产物 N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基 - 对苯二胺醌 (6PPD-Q) 对某些鲑科鱼类具有急性毒性，然而当前的风险阈值仅源自恒定浓度暴露测试，这些测试无法代表城市径流对地表水的间歇性、雨水驱动脉冲模式。在此，我们将虹鳟暴露于四次 8 小时的 6PPD-Q 脉冲中，浓度处于环境相关水平 (0.125–1.95 μg/L)，随后进行 14 天的恢复期。由此得出的多脉冲 LC50 (0.28 μg/L) 显著低于标准恒定暴露生物测定法中的阈值。值得注意的是，恢复期间发生了大量延迟死亡，且环境中 6PPD-Q 的脉冲经常达到或超过引发此类延迟死亡的水平。在四次连续脉冲和恢复期期间观察到不同的致死表型，表明差异化的处置和/或毒性途径影响了每个阶段。此外，幸存鱼类即使在 14 天恢复期后仍表现出显著的行为障碍，表明存在长期的亚致死影响。总之，我们的研究结果表明，环境逼真的脉冲暴露方案和延迟毒性是 6PPD-Q 生态风险中关键但常被忽视的组成部分，应予以考虑以支持对城市流域中 6PPD-Q 危害的更环境逼真的评估。

引言
N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基 - 对苯二胺醌 (6PPD-Q)，是轮胎抗氧化剂 N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基 - 对苯二胺 (6PPD) 的转化产物，已导致太平洋西北地区洄游产卵的银大麻哈鱼 (Oncorhynchus kisutch) 大量死亡。(1) 随后的研究表明，6PPD-Q 对其他鲑科物种也具有急性毒性，包括溪鳟 (Salvelinus fontinalis)(2) 和虹鳟 (Oncorhynchus mykiss)。(2?6) 由于 6PPD 在轮胎制造中的广泛使用，6PPD-Q 在全世界地表水中频繁被检测到。(7?11) 在城市溪流中，6PPD-Q 浓度通常报告在亚 ng/L 至数百 ng/L 的范围内，(12) 而在高交通流量的城市，城市径流水平可达 μg/L 级别，例如美国西雅图 (2.3 μg/L)(13) 和中国香港 (2.43 μg/L)，(10) 导致 6PPD-Q 以脉冲形式间歇性引入水生系统。在此类高浓度脉冲期间，河流中的 6PPD-Q 浓度可能超过幼龄银大麻哈鱼的半数致死浓度 (LC50, 41 ng/L)，并持续在较高水平长达 3.5–18.7 小时。(14, 15) 这些脉冲在雨季频繁发生，导致水生生物遭受重复的、间断性的暴露，这 inherently 挑战了依赖连续浓度生物测定反应得出的效应阈值的传统风险评估方法。(16)

尽管已有几项研究报告了 6PPD-Q 对鲑鱼类的 LC50 值，但这些数据源自恒定浓度暴露，而在自然环境中这种情况很少发生。此类传统的标准化生物测定法通常忽略了暴露后效应，包括延迟死亡。(17?19) 延迟死亡是指暴露停止后逐渐显现的致死效应，其特征是显著的滞后期和时间依赖性积累。(20) 因此，当发生脉冲暴露时，源自传统恒定浓度暴露实验设计的毒性阈值可能无法反映实际的生态风险。(21)

除了死亡率，运动行为也是评估神经毒素不良后果的重要终点。据报道，6PPD-Q 会引发浓度依赖性神经行为障碍（即低于 0.73 μg/L 的浓度会导致虹鳟活动过度），而较高浓度则导致抑郁行为。(6) 暴露于亚致死浓度的 6PPD-Q 少于 24 小时会损害敏感物种的游泳能力。(22, 23) Cheng 等人 (5) 发现，6PPD-Q 显著减少了总移动距离和平均游泳速度，导致运动障碍。这些观察结果很重要，因为行为对于鱼类的生存、繁殖和健康至关重要。(24, 25) 然而，脉冲式 6PPD-Q 暴露后虹鳟的游泳能力是否恢复仍然是一个环境上重要的未知因素。本研究的目标是检查脉冲式 6PPD-Q 暴露对虹鳟 (O. mykiss) 的潜在延迟效应，虹鳟是水生风险评估中广泛使用的模式物种，且已知对 6PPD-Q 敏感。(2, 3, 26) 具体而言，我们的目标是：(1) 确定脉冲式 6PPD-Q 暴露对虹鳟的急性毒性，包括四次由不同恢复间隔分隔的脉冲暴露，以模拟间歇性降雨事件；(2) 量化在最后一次脉冲暴露后两周恢复期后是否发生延迟毒性；以及 (3) 评估恢复期结束时幸存个体的运动游泳行为，确定被破坏的虹鳟运动行为在脉冲式 6PPD-Q 暴露后是否可恢复。

材料与方法
脉冲暴露实验
为了模拟现实世界的降雨事件，我们建立了一种间歇暴露模式，包括四次脉冲和恢复期 (图 1a 和图 S1)。四次脉冲暴露每次持续 8 小时，连续脉冲之间的恢复期分别为 1.75、3 和 1 天。在第四次脉冲之后，启动 14 天恢复期以量化是否发生延迟死亡。在此 14 天恢复期结束时，检查幸存鱼类的运动活动以表征运动游泳行为。该暴露方案是基于 King 等人 (14) 的现场观察设计的，他们追踪了四个雨季降雨事件期间一条银大麻哈鱼溪流中的 6PPD-Q 浓度。在那项研究中，降雨后溪流浓度迅速升高，并保持在幼龄银大麻哈鱼 LC50 以上长达 3.5–18.7 小时，连续降雨事件之间的间隔为 2、8、1 和 4 天。

图 1 查看大图 下载至幻灯片
图 1. (a) 脉冲暴露期间测量的 6PPD-Q 浓度。五种颜色代表五个处理组。每次脉冲暴露持续 8 小时，连续脉冲之间的恢复期分别为 1.75、3 和 1 天，第四次脉冲后跟随 14 天的最终恢复期。双头箭头标记了恢复期的持续时间。(b) 虹鳟在 21 天期间暴露于 6PPD-Q 时的生存时间过程 (n = 30)。浅粉色区域表示在此期间发生了脉冲暴露。第四次脉冲暴露结束时和 14 天恢复期结束时的延迟死亡展示在图形的右侧。水平虚线表示第四次暴露结束时的死亡率，百分比表示每种浓度下的延迟死亡率。(c) 四次脉冲暴露中的不同致死表现。测定了 14 天恢复期结束时幸存鱼类的平均游泳速度。数据以均值 ± 标准误 (SE) 表示，n = 3。使用 Welch 单因素方差分析 (ANOVA) 和 Dunnett's T3 事后检验来比较对照组和 6PPD-Q 处理组之间的差异。(* P < 0.1, ** P < 0.01)。

关闭图 1. 孵化后 20 天的三倍体虹鳟 (平均体长 ～2.5 cm，平均体重 ～0.2 g) 被放入 5-L 烧杯中，暴露于 6PPD-Q 的标称浓度 0、0.15、0.3、0.45、0.9 和 1.8 μg/L 中 (表 S1)。同时进行溶剂对照 (0.02% 丙酮) 评估。每种处理进行三次重复，每个烧杯中有 10 条鱼，装载浓度保持在 0.5 g 鱼/L 以下。(27) 每次脉冲暴露结束时，将幸存鱼类小心转移至装满未加药通气自来水的 5-L 烧杯中恢复。暴露前 48 小时及整个暴露期间均未进行喂养。所有动物饲养和实验程序均遵循广东省实验动物监测研究所批准的方案 (IACUC2026105)。在每次脉冲暴露的开始和结束时采集水样进行化学分析。恢复期间，每天喂养一次，并在每次喂养后 6 小时更换 50% 的水。水质参数在每次换水前后每天测量 (表 S2)，并每半天记录一次死亡率 (表 S3)。虹鳟饲养和水浓度测量的详细信息见支持信息。

运动行为测试
在 14 天恢复期后，按照 EthoCRED 报告标准 (表 S5) 进行运动行为评估。(28) 所有鱼类维持在约 13 °C，并在观察前适应 20 分钟，随后使用安装在烧杯上方的相机连续记录其运动 5 分钟。数据使用 EthoVision XT 14 软件分析。

统计分析
每次脉冲暴露的浓度计算为 0 和 8 小时测量值的平均值。使用 Shapiro-Wilk 检验和 Brown-Forsythe 检验分别对行为数据进行正态性和方差齐性评估。由于方差齐性假设被违反，进行了 Welch 单因素方差分析 (ANOVA) 并配合 Dunnett's T3 事后检验。

结果与讨论
基于多次脉冲暴露的毒性阈值
水中 6PPD-Q 的测量梯度浓度为 0.125 ± 0.01、0.30 ± 0.02、0.44 ± 0.05、0.87 ± 0.09 和 1.95 ± 0.16 μg/L (表 S1)。在暴露期间，6PPD-Q 浓度降低了 1% 至 38%，与先前报告的损耗一致。(2, 3) 四次脉冲暴露之间的浓度最大变化为 21%，证实了暴露条件的稳定性。基于脉冲暴露 (总暴露时间：32 小时) 确定的虹鳟 6PPD-Q LC50 为 0.28 μg/L (95% 置信区间为 0.20 至 0.36 μg/L) (图 S2)。对于虹鳟，先前研究已记录了 24 小时和 96 小时的 LC50 值。(2?6) 在本研究中，第一次脉冲期间观察到的死亡率与 Roberts 等人 (3) 报告的类似，他们暴露了相似生命阶段的虹鳟幼鱼，获得了 24 小时 LC50 为 0.6 μg/L。幼鱼的敏感性明显高于较老的鱼 (2 岁和 3 个月大)，后者的 24 小时 LC50 值分别为 1.96(2) 和 0.9 μg/L。(6) 这一发现与早先报告显示虹鳟早期生命阶段对 6PPD-Q 更敏感的结果一致。(3)

相比之下，在恒定暴露条件下，相似生命阶段虹鳟的 48 小时和 96 小时 LC50 值分别为 0.56 和 0.47 μg/L，(3) 均高于本研究中确定的脉冲 LC50。这种差异可能反映了与重复脉冲暴露相关的累积毒性和延迟效应，这是传统恒定暴露测试无法捕获的。基于现有数据，本研究中测试的虹鳟离膜幼鱼在比较物种中的敏感性排名第四，排在溪鳟，(4) 沿海切喉鳟，(23) 和银大麻哈鱼，(4) 之后，但高于湖鳟和其他物种。(29?31) (表 S4)。这一排名修正了先前从传统毒性测试中得出的观念，即湖鳟比虹鳟更敏感。(3, 29) 尽管如此，跨研究的比较应谨慎解释，因为其他物种的 LC50 值源自恒定暴露测试，而本研究采用的是脉冲暴露设计。这些结果表明，传统毒性方案可能会低估 6PPD-Q 的环境危害，因为此类测试无法捕获延迟毒性和重复脉冲暴露的累积效应。(18, 20) 相比之下，此处使用的脉冲暴露范式更贴近环境逼真的暴露模式，特别是在降雨事件期间，同时也捕获了时间依赖性效应。

连续脉冲暴露下的死亡动力学

四次连续脉冲暴露期间的死亡情况表现出明显的时间模式，且该模式随暴露史的变化而变化（图1b）。在第一次8小时脉冲暴露期间，1.95 μg/L组的死亡始于暴露后3小时，显著死亡发生在暴露后3至5小时之间。在0.87和0.44 μg/L组中，逐渐死亡始于暴露后6小时。第二次暴露期间的死亡低于第一次。在第三次和第四次暴露期间，虽然总体死亡率低于第一次脉冲，但在低浓度组中也观察到了死亡。死亡在第一次暴露期间达到峰值，这可能是因为鱼类缺乏先前的适应。（32, 33）存活个体可能获得耐受性，这将在后续暴露中降低相同浓度下的急性死亡率。然而，亚致死性损伤随连续脉冲的增加而增加，如在后续暴露中低浓度组出现死亡所证明的那样。

恢复期各阶段的浓度依赖性延迟死亡

脉冲式6PPD-Q暴露后的延迟死亡表现出明显的浓度依赖性模式，且在短期和长期恢复期内均持续存在。第一次脉冲后立即，最高浓度组出现快速死亡，即在转移后0.5小时内有四条鱼死亡。第二次恢复期未发生死亡。然而，在第三次恢复期，即使在最低测试浓度下也出现了延迟死亡（图1b）。总之，这些结果表明，延迟死亡不仅依赖于浓度，而且在重复脉冲后即使在最低测试浓度下也会发生。关键的是，这种致死浓度具有环境相关性。在降雨期间，一条含有银鲑（coho salmon）的溪流中6PPD-Q峰值达到0.237 μg/L，（14）而Don河中的浓度尽管被稀释，但最高仍保持在2 μg/L以上长达10小时。（8）因此，环境脉冲经常达到或超过引起显著延迟死亡的浓度水平。鉴于此类脉冲在雨季会多次重复出现，此处观察到的累积延迟死亡表明，未考虑暴露后效应的传统急性毒性测试可能会严重低估6PPD-Q对城市流域中这些鲑科鱼类实际致死风险。

在最后的14天恢复期内，出现了最明显的延迟死亡。在最高浓度组中，仅有一条鱼在四次脉冲中存活，无法进行延迟死亡分析。在其余各组中，暴露停止后死亡率大幅增加，即在0.125 μg/L下从7 ± 6%增加到23 ± 6%（延迟死亡17%）；在0.30 μg/L下从7 ± 6%增加到57 ± 6%（延迟死亡50%）；在0.44 μg/L下从33 ± 6%增加到60 ± 10%（延迟死亡27%）；在0.87 μg/L下从57 ± 6%增加到83 ± 6%（延迟死亡27%）（图1b）。值得注意的是，延迟死亡并非严格随浓度单调变化。中等浓度组（0.3 μg/L）表现出最高的延迟毒性（50%），而较高浓度（0.44和0.87 μg/L）显示出较低的延迟死亡率（均为27%）。此前在Ceriodaphnia dubia中对锌的研究也报道了类似的模式，但其机制仍不清楚。（34）我们假设这种现象反映了不同的作用方式或机制。已知高浓度的6PPD-Q会靶向大脑并引发神经毒性效应，（5, 6, 35）这可能不是延迟死亡的主要驱动因素。相比之下，实验处理引发的效应可能与主导延迟死亡的效应相吻合。

有趣的是，1.95 μg/L组中仅存的那条鱼在恢复期的前8天保持良好状态。Roberts等人（3）也观察到，在其最高浓度组中存活的三条鱼一直活到暴露结束（28天）。然而，在本研究中，这条鱼在恢复期第8天停止进食，随后出现沉底行为，并于第10天死亡，死亡时观察到腹部破裂和多处出血。这一案例进一步强调，延迟毒性可能在暴露停止数天后才表现出来，并凸显了在风险评估框架中纳入长期恢复观察期的必要性，至少对于引发类似6PPD-Q毒性效应的化合物而言。

三条证据表明，延迟毒性并非源于残留化合物或其他慢性毒性过程，而是源于脉冲暴露期间启动、并在清除后持续存在的持久生物效应。第一，转移到不含6PPD-Q的水中终止了外部暴露。第二，我们此前的毒代动力学数据显示，转移后2小时内，全身6PPD-Q残留量降至检测限以下，证实了快速清除。（36）第三，同期对照组在21天的测试期间仅出现3%的死亡率，排除了其他应激因素。这一解释凸显了需要进一步进行毒理学研究，以阐明延迟毒性的机制。（37）

脉冲暴露与恢复期各阶段的特异性临床特征

在濒死的虹鳟中观察到的临床特征在四次连续脉冲暴露和随后的恢复期之间差异显著，显示出主导毒性表现形式的渐进性转变。在第一次8小时脉冲期间，所有死亡的鱼在死前均表现出喘息、失去平衡和螺旋游泳（图1c和视频不可用），这一症状复合体统称为城市径流死亡综合征（URMS），与其他敏感鲑科鱼类的报道一致。（2, 38）值得注意的是，在第一次脉冲后转移到清水中的几条鱼也死亡并表现出典型的URMS症状，证实即使暴露停止后也可能发生延迟死亡，这与在银鲑中的观察结果一致。（38, 39）这一早期阶段综合征很可能归因于神经毒性。6PPD-Q可能破坏血脑屏障，渗透到大脑并扰乱谷氨酸-谷氨酰胺循环，导致不可逆的神经损伤。（5, 35, 40）

在第二次暴露期间，临床表现发生了显著转变。死亡的鱼仅表现出喘息，没有典型的螺旋游泳或失去平衡（图1c和视频不可用）。这种孤立的呼吸窘迫与耗氧量增加一致，而耗氧量增加是影响心肺功能的毒物的典型反应。（41?43）因此，喘息和升高的通气速率似乎是生理应激下增强氧气摄入的代偿策略。

在第三次和第四次脉冲期间，与URMS相关的症状完全消失。取而代之的是，在头部、背部或腹部观察到出血，其中腹部出血最为普遍（图S5）。这种血管表型可能是6PPD-Q引起的血管通透性增加导致全身血管损伤的结果。（3, 35, 40, 44）

恢复期（即第四次脉冲后）的延迟死亡呈现了第四种独特表型，与急性致死暴露后立即发生的URMS驱动的死亡有根本区别。受影响的鱼并未出现螺旋游泳或喘息，而是表现出游泳能力的显著下降，随后沉底并静止不动，在该行为出现后约1至2天死亡（视频不可用）。这种"沉底静止"的延迟死亡此前未曾报道。已知亚致死浓度的6PPD-Q会负面影响虹鳟的心肺生理和能量代谢，并损害湖鳟和沿海切喉鳟的游泳能力。（22, 23, 41）因此，我们假设这种延迟死亡与进行性心肺功能障碍和代谢损伤有关，而非急性神经毒性。显然，导致本研究结果的各种机制值得进一步研究。总之，这些阶段性特异性临床特征，即从URMS（第1次脉冲）到孤立喘息（第2次脉冲），再到出血（第3至4次脉冲），最后到沉底静止（恢复期），暗示了主导作用方式或机制的时间演变。后续暴露轮次中URMS症状的逐渐丧失以及延迟性非URMS死亡的显现，表明在暴露和恢复的不同阶段，不同的毒性途径占主导地位。其潜在机制，尤其是神经毒性、心肺和血管病理之间的转变，需要进行系统研究。

脉冲暴露及恢复期后存活鱼类的持续性行为损伤

经过14天恢复期后，存活的虹鳟表现出明显的浓度依赖性行为损伤，并分化为两种独特表型，即中等浓度下的过度活跃和较高浓度下的活动不足，表明亚致死神经行为效应在暴露停止后仍长期持续。0.44 μg/L组的鱼表现出明显的趋壁偏好（贴壁行为），这是动物和人类中已确立的焦虑指标（图S6）。（45）在虹鳟连续暴露于6PPD-Q 24小时后也观察到了相同的行为模式。（6）此外，这些鱼表现出显著的过度活跃。平均游泳速度从对照组的3.25 ± 0.06 cm/s增加到5.22 ± 0.11 cm/s，总游动距离从958 ± 26 cm增加到1368 ± 25 cm（图S6）。暴露于0.20–0.73 μg/L 6PPD-Q 24小时的虹鳟（6）以及暴露于2 μg/L 6PPD-Q 30天的斑马鱼（平均速度增加41%）（46）中也报道了类似的过度活跃。此类行为改变归因于6PPD-Q的精神兴奋作用，其扰乱神经递质并损害神经功能。（6）关键的是，我们发现这种过度活跃在14天恢复后仍然存在，这表明中等浓度6PPD-Q诱导的神经毒性损伤并非完全可逆。

相比之下，0.87 μg/L组的鱼表现出明显的运动抑制。平均游泳速度降至1.26 ± 0.38 cm/s，总游动距离仅为368 ± 121 cm，累积静止时间从对照组的31.1 ± 6.56 s显著增加到192 ± 31.6 s（图S6）。这种活动不足表型与本研究中延迟死亡前观察到的沉底和静止现象一致。这种抑制可能源于心肺和代谢功能受损（22, 41），或源于乙酰胆碱酯酶抑制，因为胆碱酯酶活性降低与虹鳟游泳能力下降相关。（6, 47）受损行为可能损害觅食和躲避捕食者等适应性行为，从而威胁鱼类的生存、生长和整体健康，并可能对野生种群的持久性产生负面影响。（24）因此，6PPD-Q脉冲暴露的长期影响值得未来关注。

环境意义

我们观察到6PPD-Q脉冲暴露后出现大量延迟死亡，这表明环境相关的降雨事件对虹鳟造成的实际致死风险远高于传统急性毒性测试所预测的水平。鉴于雨季期间6PPD-Q脉冲频繁重复出现，将延迟毒性纳入生态风险评估框架具有关键的实践意义。对于更敏感的物种，如银鲑和溪鳟，迫切需要验证6PPD-Q脉冲暴露后延迟死亡的研究。此类研究将能够更准确地评估流域尺度的间歇性暴露以及6PPD-Q对敏感物种的长期影响，从而改进道路径流中新污染物风险的管理策略。此外，我们观察到的恢复期后持续的行为缺陷以及亚致死浓度组中的延迟死亡，强调了研究亚致死毒性和优先研究6PPD-Q持久毒性效应的必要性。