产甲烷氧化菌衍生的活性氧物种促进稻田土壤中砷的氧化

《Environmental Science & Technology》：Methanotroph-Derived Reactive Oxygen Species Facilitate Arsenic Oxidation in Paddy Soils

　　

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摘要

活性氧（ROS）越来越多地被认为是土壤氧化还原过程中的重要氧化剂，微生物产生的ROS广泛参与元素的转化。鉴于稻田土壤中存在活跃的甲烷氧化作用，甲烷氧化菌具有产生大量ROS的潜力，但其在As(III)氧化中的作用仍不明确。在此，我们鉴定出甲烷氧化菌产生的ROS是稻田土壤中As(III)氧化的一条重要但此前被忽视的途径。土壤微宇宙实验和纯培养实验表明，甲烷氧化促进了ROS介导的As(III)氧化，其中H2O2被确定为主要的ROS种类。抑制剂试验和功能基因分析表明，氧活化与呼吸电子传递与甲烷氧化过程中的ROS产生密切相关。这些发现揭示了甲烷氧化菌产生的ROS作为一条独特的途径，在专门的亚砷酸盐氧化酶之外对As(III)氧化做出了贡献。通过揭示甲烷代谢与砷转化之间被忽视的联系，本研究扩展了我们对砷生物地球化学的理解，并为农业生态系统中甲烷排放和砷毒性的协同减轻提供了概念基础。

1. 引言

稻田土壤中的砷污染已成为全球粮食安全和人类健康的重要威胁。(1, 2) 近期证据表明，即使长期食用砷含量符合监管标准的稻米，仍会对人类健康构成重大风险。(3) 水稻种植中典型的长期淹水条件产生还原环境，促进砷酸盐[As(V)]向亚砷酸盐[As(III)]的转化，而后者表现出显著更高的迁移性和生物可利用性。(4) 因此，As(III)被水稻根系高效吸收，并不成比例地导致砷在可食用谷物中的积累。因此，As(III)向As(V)的氧化被广泛认为是控制稻田土壤中砷滞留的关键生物地球化学过程，因为它通过吸附或与铁(氢)氧化物共沉淀促进砷的封存。(5)

传统上，亚砷酸盐氧化被归因于亚砷酸盐氧化微生物介导的酶促反应，其中亚砷酸盐氧化酶AioAB直接催化As(III)向As(V)的转化。(4, 6) 相比之下，近期研究表明，活性氧（ROS）可能代表了一种额外但被低估的机制，参与土壤中氧化还原敏感元素的氧化。(7, 8) 例如，稻田土壤排水过程中产生的羟基自由基热点促进了As(III)氧化，从而将As溶解度降低高达48%。(9) ROS在稻田土壤中可能尤为重要，因为频繁的氧化还原波动有利于其瞬时形成，而其强氧化能力使其能够在不需要专门的亚砷酸盐氧化酶的情况下氧化As(III)。在微生物系统中，ROS可通过涉及含金属氧化酶的代谢过程产生，其中不完全的氧还原或电子泄漏可产生如过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2•–）和羟基自由基（•OH）等ROS。(10, 11) 越来越多的证据表明，微生物产生的ROS可驱动环境重要元素及其相关污染物的转化，突显了其在生物地球化学循环中的更广泛作用。(12, 13) 因此，ROS可能在微生物代谢与As(III)氧化之间提供机制性联系，即使对于传统上未被认为能氧化亚砷酸盐的微生物也是如此。然而，稻田土壤中ROS介导As(III)氧化的关键产ROS类群和代谢过程仍知之甚少。淹水稻田是甲烷（CH4）循环的主要热点，拥有大量活跃氧化甲烷的原地甲烷氧化菌群。(14, 15) 好氧甲烷氧化主要由甲烷单加氧酶（MMO）介导，这是一种含铜或铁的酶，催化甲烷氧化过程中的分子氧活化。(16) 现有关于甲烷-砷耦合的研究主要关注还原性转化。例如，已有研究表明好氧甲烷氧化可促进As(V)还原。(17) 然而，MMO对分子氧的活化以及好氧甲烷氧化所需的持续胞内电子传递，可能导致不完全氧还原或电子泄漏，从而产生ROS作为代谢副产物。(18, 19) 鉴于甲烷氧化菌在淹水稻田土壤中的丰富度和活性，甲烷氧化可能是这些环境中一种重要但被忽视的生物源ROS来源。这种潜在的ROS介导氧化途径在很大程度上被忽视了，限制了当前对好氧甲烷氧化如何影响砷形态的了解。据此，我们假设好氧甲烷氧化菌释放ROS作为代谢副产物，且这些ROS参与稻田土壤中的As(III)氧化。为验证这一假设，我们研究了甲烷氧化菌产生的ROS在稻田土壤As(III)氧化中的作用。具体而言，我们旨在（i）确定甲烷氧化是否促进ROS产生并驱动稻田土壤中As(III)向As(V)的氧化，（ii）鉴定主要的ROS种类并探索可能与ROS形成相关的代谢过程，（iii）评估ROS介导的As(III)氧化能否在长期培养中维持并探索其与相关功能基因的潜在关联，以及（iv）在纯培养条件下验证甲烷氧化菌介导的ROS产生和As(III)氧化。综合这些方法，有助于阐明甲烷氧化与砷氧化之间的潜在联系，推进我们对淹水农业生态系统中碳循环与砷解毒之间相互作用的理解。

2. 材料与方法

2.1. 土壤采集与表征

稻田土壤采集自中国浙江省上虞区（30°00′N, 120°80′E）一淹水稻田的顶部20 cm土层。采集后，土壤样品立即在冰上运送至实验室。土壤的详细特性已有先前报道。(20) 简要而言，土壤质地为粉黏壤土，含4.0%黏土、50.0%粉砂和46.0%砂。土壤pH为6.23，有机质含量为40.20 g kg–1。As、Fe和Mn的总浓度分别为56.69 mg kg–1、3.34 g kg–1和0.30 g kg–1。

2.2. 土壤微宇宙实验

本研究开展了一系列土壤微宇宙培养实验，以研究甲烷氧化对ROS产生及ROS介导As(III)氧化的影响。将5 g稻田土壤置于125 mL血清瓶中，随后加入超纯水建立1:10（w/v）的土水比。(21) 用N2对瓶子吹扫30 min，用丁腈橡胶塞密封，然后在25 °C黑暗条件下厌氧培养10天。该预培养程序用于激活本土微生物并最小化替代电子受体的影响，包括硝酸盐、硫酸盐、土壤有机质和铁矿物。(22) 预培养后，将部分土壤样品在120 °C下高压灭菌30 min。(23) 每个处理设置三次重复。对于As(III)氧化实验，加入NaAsO2使As(III)最终浓度达到50 μM。对于ROS清除处理，分别加入N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC, 1 mM），(24) 超氧化物歧化酶（SOD, 0.2 mg L–1），(25) 过氧化氢酶（CAT, 200 kU L–1），(26) 和叔丁醇（TBA, 10 mM）(27) 来清除总ROS、O2•–、H2O2和•OH。各采样时间点ROS介导的As(III)氧化量估算为Ot=Cscavenger,t?Ccontrol,t，其中Ot代表时间t时ROS介导的As(III)氧化量，Cscavenger,t和Ccontrol,t分别代表时间t时配对处理（有/无对应ROS清除剂）中的As(III)浓度。所有处理随后在25 °C黑暗好氧条件下培养。对于CH4处理，向顶空部分供给甲烷，最终浓度为10%（v/v）。(28, 29) 在指定采样时间（0、2、6、12和24 h），取1 mL土壤悬液，通过0.22 μm膜过滤以去除悬浮土壤颗粒，所得土壤溶液留待后续分析。用于砷分析的样品随后用6 M HCl酸化保存。

2.3. 酶抑制实验

酶抑制实验遵循第2.2节所述的土壤微宇宙设置、预培养和采样程序。简要而言，将5 g稻田土壤和50 mL超纯水加入125 mL血清瓶中。10天厌氧预培养后，加入As(III)至最终浓度50 μM。分别施加烯丙基硫脲（ATU, 0.1 mM），(30) 胡椒环丁醚（PBO, 5.0 mM），(31) 鱼藤酮（ROT, 0.4 mM），(32) 双香豆素（DIC, 0.4 mM），(33) 和甲霜灵（FAM, 0.4 mM）(33) 来分别抑制颗粒型甲烷单加氧酶（pMMO）、细胞色素P450（CYP450）、NADH泛醌氧化还原酶（复合体I）、辅酶Q（CoQ）和细胞色素bc1复合体（复合体III）。每个处理设置三次重复。抑制剂母液用DMSO配制，所有处理（包括无抑制剂对照）均含有0.2%（v/v）DMSO，该浓度此前报道不会影响微生物活性。(34) 所有处理供给10% CH4，在25 °C好氧黑暗条件下培养，并在0、2、6、12和24 h时采样。

2.4. 长期土壤培养

对于长期培养实验，将15 g稻田土壤和150 mL超纯水加入330 mL血清瓶中。设置四个处理：CK、CK加NAC、CH4和CH4加NAC。所有处理均加入与短期实验相同浓度的NaAsO2。向CH4处理组的顶空部分加入10%甲烷。在25 °C好氧黑暗条件下培养。每7天向瓶内引入空气以维持好氧条件。随后向相应处理组补充CH4、As(III)和NAC以维持指定培养条件。每个处理设置三次重复。

2.5. 纯培养

使用II型甲烷氧化菌Methylocystis parvus OBBP直接测试甲烷氧化过程中产生的ROS是否在纯培养条件下促进As(III)氧化。首先将菌株按5%（v/v）接种量接种于250 mL氮源矿物盐培养基中（组成见表S1），在30 °C、200 rpm、黑暗好氧条件下培养，顶空部分供给20%甲烷。(35) 达到对数生长期后，将1%（v/v）的培养液转移至无菌血清瓶中的40 mL新鲜矿物培养基中以开始培养。向顶空部分供给10%（v/v）甲烷，(29, 35) 所有处理在30 °C、200 rpm、黑暗好氧条件下培养。对于砷氧化实验，在培养开始时加入无菌NaAsO2溶液使As(III)最终浓度达到20 μM。设置四个处理：（i）无细胞对照，（ii）无细胞对照加ROS清除剂，（iii）活细胞处理，（iv）活细胞处理加ROS清除剂。ROS清除剂与土壤培养实验中使用的一致。从第0天至第6天，每天同一时间用无菌注射器采集液体样品。取200 μL样品直接转移至96孔板进行OD600测量。剩余样品通过0.22 μm膜过滤，滤液用于ROS定量或砷形态分析，采用与土壤培养实验相同的程序。所有处理设置三次重复。

2.6. 化学分析

砷形态使用高效液相色谱（HPLC, PerkinElmer Series 200）联用电感耦合等离子体质谱（ICP–MS, NEXION300X）进行检测，使用阴离子交换PRPX-100 HPLC柱（250 × 4.1 mm I.D, 10 μm；Hamilton, Reno, NV, USA），流动相为20 mM NH4H2PO4（pH 6.5）。(36) 建立了四个对应的砷形态标准曲线，使用含As(III)、As(V)、单甲基胂酸（MMA）和二甲基胂酸（DMA）的四种混合标准样品，浓度范围为0 μg L–1至200 μg L–1。四种砷形态的相关曲线R2值均大于0.999。根据先前研究建立的方案，(37?39) 使用特异性化学探针定量稻田土壤中的三种ROS：TPA用于•OH，XTT用于O2•–，Amplex Red用于H2O2。探针在培养前加入系统中，在指定采样时间测定ROS浓度。简要而言，O2•–产生通过XTT-甲臜在470 nm处的吸光度定量。H2O2使用Amplex Red-HRP法在570 nm处定量，并在700 nm处进行背景校正。hTPA通过HPLC荧光检测定量，激发和发射波长分别为250和410 nm。先前的研究表明这些探针在土壤上的吸附量很小，验证了其在ROS检测中的应用。(40) 详细的实验方法见补充材料S2。

2.7.

宏基因组测序与数据分析

在长期培养的第42天采集土壤样品进行DNA提取和宏基因组测序。这些数据用于鉴定与甲烷氧化菌来源活性氧（ROS）相关的功能基因。详细方法见文本S2和S3。

3. 结果与讨论

3.1 甲烷氧化促进ROS介导的砷氧化

在24小时培养过程中，As(III)浓度逐渐降低，表明实验过程中发生了As(III)氧化（图1a,c）。加入NAC（一种广谱ROS清除剂）显著抑制了CK和CH?处理中As(III)的氧化（图1a），表明ROS参与了As(III)氧化。在本研究中，以As(III)浓度作为氧化的主要指标，因为As(V)可被土壤矿物轻易固定，??1?这可能使As(III)氧化的定量复杂化并导致对氧化能力的低估。基于NAC诱导的抑制作用，随后将ROS对As(III)的氧化量估算为无NAC处理与有NAC处理之间的差值（图1b）。结果显示，在大多数时间点，添加CH?后ROS对As(III)的氧化量显著高于CK处理，在24小时时，计算出的氧化量从CK条件下的1386.07 μg L?1增加到CH?条件下的1674.04 μg L?1。值得注意的是，在灭菌土壤中，与CK相比，添加CH?并未引起ROS产生或As(III)氧化的显著变化（图S1），表明CH?诱导的ROS介导As(III)氧化的增强依赖于微生物活性。这些结果表明，甲烷氧化增强了稻田土壤中生物来源ROS对As(III)氧化的贡献。

图1 甲烷添加对稻田土壤As(III)氧化和ROS产生的影响。（a,c）溶解态As(III)浓度。灰色和蓝色阴影分别代表CK和CH?处理。（b）总ROS对As(III)的氧化量。（d）O?•?、H?O?和•OH对As(III)的氧化量。堆叠值仅用于可视化，不代表ROS介导的As(III)氧化总量，因为从单一ROS清除剂处理推断出的效应不具有加和性。（e）O?•?产生量。（f）H?O?产生量。（g）•OH产生量。数据以均值±标准差表示（n = 3）。*表示P < 0.05，**表示P < 0.01，***表示P < 0.001。

我们进一步使用了三种环境中重要ROS的特定清除剂——羟基自由基（•OH）、超氧阴离子（O?•?）和过氧化氢（H?O?）——来鉴定参与As(III)氧化的关键ROS（图1c）。所有清除剂处理在不同程度上抑制了As(III)氧化，表明多种ROS参与了氧化过程。经计算的单一ROS贡献进一步表明，在甲烷条件下H?O?是As(III)氧化中相对突出的贡献者，而•OH和O?•?的贡献相对较小（图1d）。在24小时时，H?O?介导的As(III)氧化量为1138.52 μg L?1，而O?•?和•OH分别为551.36 μg L?1和411.96 μg L?1。ROS的直接定量也支持了上述观察结果，CH?添加使•OH、O?•?和H?O?的产生量相对于CK有所增加（图1e–g）。在检测到的ROS中，H?O?积累量最高，在24小时时达到7.73 μM，而•OH和O?•?相对较低，浓度分别为3.78 μM和2.03 μM。值得注意的是，在不含土壤和微生物细胞的培养基中，添加各清除剂与未添加处理之间As(III)浓度无显著差异（图S5和4a–c）。该结果支持了清除剂对砷形态的直接效应相对较小的解释。因此，CK与添加清除剂的土壤培养之间的差异主要归因于ROS相关As(III)氧化的抑制。H?O?的主导作用是合理的，因为H?O?比O?•?和•OH更稳定，??2?允许其在土壤溶液中扩散??3?并在培养期间维持氧化反应。相比之下，O?•?是一种瞬态中间体，可通过歧化迅速转化为H?O?，????这可能解释了其贡献相对较小的原因。此外，尽管•OH反应活性极高，??2?但它易被有机物、矿物及其他土壤组分消耗，???, ???限制了其在非均质土壤系统中对As(III)氧化的有效贡献。

尽管甲烷氧化菌来源的ROS可能对As(III)氧化做出不可忽略的贡献，但该途径应与经典的AioAB依赖型氧化途径并驾齐驱地考虑。AioAB直接催化As(III)氧化，且仅限于拥有并表达AioAB的微生物。该途径可在好氧和厌氧条件下运行，????在厌氧条件下硝酸盐可充当替代电子受体。???, ???相比之下，甲烷氧化菌来源ROS介导的As(III)氧化是一种间接过程，不需要编码专一亚砷酸盐氧化酶的基因。因此，这两种途径可能在好氧条件下共存，而在存在硝酸盐且好氧甲烷氧化受限的厌氧条件下，AioAB依赖型氧化可能变得更加重要。此外，稻田土壤中的甲烷氧化会释放丙酸和乙酸等中间产物，可通过代谢交叉喂养被非甲烷氧化菌吸收。????鉴于许多亚砷酸盐氧化细菌为异养菌，????甲烷氧化有可能刺激非甲烷氧化菌型亚砷酸盐氧化细菌的生长或活性。然而，当前数据无法直接评估这一可能性，也无法定量解析稻田土壤中As(III)氧化背后多种生物和非生物过程的相对贡献。因此，需要进一步开展针对性的田间尺度研究。

3.2 酶抑制实验揭示与甲烷氧化菌来源ROS介导As(III)氧化相关的代谢过程

培养6小时后，特异性抑制剂有效抑制了As(III)氧化，而未施加有效抑制的处理中As(III)持续被氧化（图2a,b）。在测试的抑制剂中，ATU、PBO和ROT表现出最显著的抑制效果，将6小时的As(III)氧化效率从对照的44.11%分别降至23.45%、17.48%和23.99%。此外，ATU、PBO和ROT的添加显著抑制了三种ROS在培养过程中的积累（图2c–e）。与直接测量结果一致，在ATU、PBO和ROT存在时，ROS净积累量明显低于对照（图2f–h）。ROS产生和As(III)氧化的同时抑制表明，这些被抑制的途径可能参与了甲烷氧化菌来源ROS对As(III)的氧化。

图2 酶抑制剂对CH?处理下As(III)氧化和ROS产生的影响。（a）培养6小时后的As(III)浓度。（b）As(III)氧化效率。C?代表0小时的初始As(III)浓度，C?代表t时刻的残余As(III)浓度。（c–e）O?•?、H?O?和•OH的产生量。（f–h）6小时内O?•?、H?O?和•OH的净产生量。数据以均值±标准差表示（n = 3）。*表示P < 0.05，**表示P < 0.01，***表示P < 0.001。

这些结果表明，甲烷氧化菌来源ROS途径可能涉及含氧酶和电子传递过程。ATU通常用作含铜单加氧酶的抑制剂，已被应用于探究pMMO相关甲烷氧化。?3?, ?1?因此，ATU敏感性下降与pMMO相关活性参与ROS形成是一致的。PBO的抑制作用同样表明细胞色素P450介导的活化可能存在潜在作用，?31?因为CYP450催化循环的解偶联可产生O?•?和H?O?作为副产物。??2?呼吸复合体I的抑制剂ROT同时降低了ROS产生和As(III)氧化，?32?表明呼吸电子传递可能参与了该过程。综上所述，这些抑制响应可能支持一个初步模型：甲烷氧化可能通过含氧酶与呼吸电子传递的协同作用刺激ROS的产生。pMMO通过其催化中心的活化作用将甲烷转化为甲醇，?1??而该过程中不完全的偶联可能导致电子泄漏至O?，从而形成ROS。??3?随后，中间产物的氧化及相关核心代谢过程可能产生NADH和NADPH。????NADH可通过复合体I支持呼吸电子传递，????而NAD(P)H来源的电子可通过同源氧化还原伴侣转移至CYP450。????这些途径中的持续电子流可能通过复合体I的电子泄漏和CYP450的催化解偶联促进ROS的形成。这些过程可导致分子氧不完全还原为O?•?，????随后O?•?歧化为H?O?，????并可能通过二次氧化还原反应进一步产生•OH。????由此产生的ROS级联反应为稻田土壤中甲烷氧化与As(III)氧化之间的机制联系提供了一个合理的途径。

3.3 甲烷氧化菌来源ROS介导砷氧化的长期评估与功能基因分析

长期培养实验揭示了稻田土壤微宇宙中砷氧化的持续性（图3a）。在长期培养过程中，NAC的添加持续抑制As(III)氧化效率，在CH?处理中抑制作用最为显著（图S2）。每次补充后，CH?浓度在连续培养周期中快速且一致地下降（图S3），证实了整个实验过程中甲烷的持续消耗和甲烷氧化的活跃进行。在整个培养期间，CH?添加条件下ROS介导的As(III)氧化贡献始终高于CK处理（图3b）。CH?持续消耗与持续升高的ROS介导氧化同时出现，表明在延长培养期间，活跃甲烷氧化与ROS相关砷转化之间的关联得以维持。

图3 长期培养中ROS介导的As(III)持续氧化及相关功能基因富集。（a）长期培养下的As(III)浓度。（b）由有无NAC处理之间的差值计算的ROS对As(III)的氧化量。（c–e）与甲烷氧化（pmoA/B/C）、细胞色素c（CYP110）和呼吸复合体I（nuoF/I/N）相关的功能基因丰度。属水平贡献率以归属于各属的注释序列比例为计算依据；主要贡献者单独列出，其余属归为"其他"。数据以均值±标准差表示（n = 3）。*表示P < 0.05，**表示P < 0.01。

为了探索与ROS产生相关的微生物过程，对与甲烷氧化和呼吸电子传递相关的功能基因进行了分析（图3c–e）。甲烷添加富集了pMMO相关基因，这些基因主要归属于甲烷氧化菌属，包括甲基菌属（Methylocystis）、甲基窦属（Methylosinus）和甲基杆菌属（Methylobacter），在CH?条件下甲基菌属占主导地位（图3c）。与CYP450和呼吸复合体I相关的基因在CH?条件下也发生了富集（图3d,e），提示胞内电子传递的遗传潜力有所增强。

这些富集模式与抑制剂实验结果大体一致：在抑制剂实验中，抑制单加氧酶活性和呼吸电子传递均降低了ROS产生量和As(III)氧化量（图2）。尽管基因丰度并不能直接指示代谢活性，但这些协同出现的模式与甲烷氧化相关的氧活化和电子传递可能参与ROS生成的假说相吻合。值得注意的是，与主要归属于经典甲烷氧化菌的pMMO相关基因不同，CYP450及nuo相关基因主要与.nonmethanotrophic（非甲烷氧化）类群相关联（图3d、e）。这一差异很可能反映了CYP450酶和呼吸复合体I在土壤细菌中的广泛分布。因此，这些基因的富集可能反映的是甲烷氧化菌及其相关非甲烷氧化菌对甲烷添加的共同响应，而非仅限于甲烷氧化菌的变化。甲烷氧化菌产生的代谢物可能通过代谢交叉供养（cross-feeding）支持邻近非甲烷氧化菌的生长与呼吸代谢，从而使这些微生物也有助于群落水平的ROS产生。然而，这些潜在相互作用仍需通过转录组学、蛋白组学及其他功能性分析进一步验证。

3.4 由甲烷氧化菌驱动的砷氧化：纯培养证据

为尽量减少土壤基质干扰，研究人员选取了土壤功能基因分析中鉴定出的一种代表性II型甲烷氧化菌——小甲烷氧化菌（*M. parvus*）OBBP菌株进行纯培养实验。在甲烷供给条件下，OBBP菌株表现出显著高于非生物对照的As(III)氧化量（图4a–f）。添加ROS清除剂后，As(III)氧化明显受到抑制，支持了ROS参与氧化过程的作用。在所测试的清除剂中，过氧化氢酶（CAT）的抑制作用最强，表明H?O?在ROS介导的As(III)氧化中起主导作用。相比之下，超氧阴离子（O?•?）和羟基自由基（•OH）的清除对氧化量的降低作用相对较小。甲烷消耗量和CO?产量（图S6a、b及S8a、b）证实了实验期间甲烷氧化过程处于活跃状态，OD???测量值（图S6c及S8c）则显示清除剂的添加并未影响微生物生长，说明As(III)氧化量的差异归因于ROS的淬灭，而非细胞活性改变。此外，OBBP菌株的甲烷氧化过程导致O?•?、H?O?和•OH积累，而非生物对照及添加清除剂处理组的ROS水平则明显较低（图4g–i）。与清除剂实验结果一致，H?O?在检测到的ROS种类中积累量最高，而O?•?和•OH则维持在相对较低水平。综合来看，这些结果提供了纯培养层面的证据，表明甲烷氧化菌可直接产生足以驱动As(III)氧化的ROS。

图4（放大查看/下载至幻灯片）图4. 小甲烷氧化菌OBBP菌株的ROS产生及ROS介导的As(III)氧化。(a–c)不同处理下的As(III)浓度。(d–f)O?•?、H?O?和•OH对As(III)的氧化贡献，由CK及CH?条件下不含清除剂与含相应清除剂处理之间的差值计算得出。(g–i)分别为O?•?、H?O?和•OH的产生量。(j–l)6天后不同抑制剂处理下O?•?、H?O?和•OH的产生量。数据以均值±标准差表示（n=3）。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。图4（放大查看/下载至幻灯片）图4. 小甲烷氧化菌OBBP菌株的ROS产生及ROS介导的As(III)氧化。(a–c)不同处理下的As(III)浓度。(d–f)O?•?、H?O?和•OH对As(III)的氧化贡献，由CK及CH?条件下不含清除剂与含相应清除剂处理之间的差值计算得出。(g–i)分别为O?•?、H?O?和•OH的产生量。(j–l)6天后不同抑制剂处理下O?•?、H?O?和•OH的产生量。数据以均值±标准差表示（n=3）。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。关闭图4。

为进一步探究与ROS形成相关的潜在生化途径，研究人员使用OBBP菌株开展了抑制剂实验（图4g–i）。ATU和ROT对As(III)氧化的抑制作用最强，使残留As(III)浓度高于对照组（图S9）。同时，各抑制剂处理组的OD???并无显著差异，表明所观察到的抑制不太可能源于短期内生物量的大幅减少（图S10c）。在所测试的抑制剂中，仅ATU显著抑制了CH?消耗（图S10a、b）。这一结果符合预期，因为ATU抑制pMMO，即负责甲烷初始氧化的酶。相比之下，ROT在不显著影响CH?消耗的情况下，明显降低了ROS积累量和As(III)氧化量，提示ROT敏感的呼吸电子传递可能参与甲烷活化下游的ROS形成，但并不控制整体甲烷氧化过程。上述处理同时降低了O?•?、H?O?和•OH的积累（图4j–l），表明抑制甲烷氧化相关的氧活化及呼吸电子传递会限制ROS产生，进而抑制As(III)氧化。与此形成对比的是，PBO在纯培养体系中作用甚微，这或许反映了OBBP菌株中CYP450的缺失或低活性，而土壤中可能含有多种受PBO敏感的微生物氧活化酶。重要的是，ROS的产生并非甲烷氧化菌独有。异养细菌可通过非光依赖代谢过程及胞外氧化还原酶产生ROS（文献57、60），而藻类的ROS产生则常与光合电子传递及NADPH依赖性氧化酶相关（文献11、61）。甲烷氧化菌或许共享普遍的呼吸电子泄漏途径，但还额外具备ROS形成与甲烷代谢之间的关联环节。具体而言，甲烷单加氧酶周转过程中的氧活化可能通过催化解偶联（catalytic uncoupling）产生ROS，而甲烷来源中间产物的逐步氧化则可提供还原力，以维持呼吸电子传递。

4. 环境意义

本研究结果支持"甲烷氧化菌来源ROS"这一被忽视的途径参与As(III)氧化，为甲烷循环与稻田土壤砷转化之间建立了新的联系。这些发现对协同管理CH?排放与砷风险具有潜在意义。通过促进As(III)氧化为迁移性较低的形态，该过程可能降低砷的生物有效性及其被水稻植株吸收的程度。水分管理调控可能为影响该过程提供一种切实可行的手段，因为间歇排水能够刺激甲烷氧化菌丰度及CH?氧化潜力，因而可能有利于甲烷氧化菌来源ROS的产生（文献62、63）。对本地甲烷氧化菌群落的生物刺激，或利用适应稻田环境的菌株进行生物强化，也可作为增强该过程的其他微生物策略。因此，该过程可能为缓解CH?排放以及降低稻田土壤砷的迁移性和毒性提供协同效益。尽管实验室培养无法完全代表稻田实际条件，但本研究团队此前的原位田间试验及其他研究已表明，稻田土壤中存在活跃的甲烷氧化过程和丰富的甲烷氧化菌群落（文献64、65）。此外，既往研究显示，即便在背景砷水平相对较低的稻田土壤中，As(III)氧化亦可以发生（文献66）。这些观察结果支持了甲烷氧化菌来源ROS在自然稻田土壤中氧化As(III)的潜力，尽管其贡献程度仍有待量化。未来研究应在空间异质、季节动态变化的稻田条件下，确定甲烷氧化菌来源ROS对砷转化的贡献，并厘清其与其他生物及非生物氧化途径的关系。确立其生态学意义将为制定田间管理策略奠定基础，从而利用甲烷氧化过程协同削减CH?排放，并降低砷在水稻中的生物有效性与积累。