电刺激是否总是对甲烷生成有效？在高导电性系统中电势和电流效应的全面评估

《Environmental Science & Technology》：Is Electro-Stimulation Always Effective for Methanogenesis? A Holistic Assessment of Electric Potential and Current Effects in Highly Conductive Systems

　　开放式图形查看器 摘要 电激发厌氧消化（EAD）通常依赖于仅电压调节，忽略了相关响应电流的影响，特别是在高导电性系统中。在这里，我们研究了一个用于处理含铁污泥消化产物的EAD系统。出乎意料的是，在0.9到1.2伏的适当施加电压下，高导电性引发了过大的电流，这随后抑制了甲烷生成。通过解耦双重电位-电流效应，并结合宏转录组分析，我们发现过大的电流在阳极生物膜上引起了严重的局部氧化应激（比CF组高2.3倍），并阻碍了碳代谢。同时，较低的阴极电位引发了微环境的碱化，加速了方解石和针铁矿的沉积，使传质阻力增加了多达1.4倍。因此，电刺激的积极生物效应（例如，Geobacter的富集，甲烷生成基因的上调）被这些由电流引起的物理和生化障碍所抵消。这项研究强调了在高度导电系统中部署电微生物技术时，共同管理电位和电流的必要性。

1. 引言 鉴于市政废水的大量排放及其所含的巨大能源潜力，从市政废水中回收能源已不再是可选项，而是实现碳中和目标的关键。(1) 厌氧消化（AD）是一种将有机物转化为生物气的高效技术。(2) 然而，在实际应用中，AD系统常常由于热力学障碍和种间电子转移（MIET）过程中的扩散受阻以及甲烷生成菌的敏感性而效率低下。(3, 4) 为了解决这些问题，提出了电刺激来提高AD性能。在电激发厌氧消化（EAD）系统中，外部电路在阳极和阴极之间提供适当的电压（0.3–1.2 V），两者都浸没在厌氧溶液中。(5, 6) 通常，这两个电极都被设计成生物电极，以支持电活性生物膜的形成并容纳其他功能性微生物。(7) 在阳极，复杂的有机物最初被发酵细菌降解并转化为挥发性脂肪酸。(8) 同时，外电子供体（例如，Geobacter）在阳极生物膜上富集，进一步氧化像醋酸这样的小分子。(5, 7) 在此过程中释放的电子通过外部电路传递到阴极，在那里，甲烷生成过程（使用CO2作为电子受体）通过直接种间电子转移（DIET）或氢-MIET途径得到增强。(9?13) 此外，电刺激还可以增强微生物的代谢活性，并在阴极附近创造一个略微碱性的微环境，从而减轻酸积累。(14, 15) 总体而言，这两种效应提高了附近甲烷生成菌对各种冲击压力的抵抗力。(10, 13, 16) 之前的研究表明，与传统AD相比，EAD系统在严重氨压或有机负荷率（OLR）高1-3倍的情况下仍能稳定运行；(13, 16) 此外，与仅添加导电生物载体相比，EAD可使甲烷产量提高20–60%。(10?12, 17?19) 在EAD系统中，电位（通常表现为施加电压）和电流是两个关键的电化学参数。电位通过维持适当的氧化还原电位提供了一个特定的厌氧环境，并为有机物向甲烷生成菌的电子转移提供了额外的潜在能量。(10, 20, 21) 与电位类似，适当的电流范围同样重要；虽然在低电流下微生物电子转移和代谢增殖可以显著增强，但过高的电流会损害正常的代谢过程。(14, 22, 23) 然而，大多数研究仅关注电位的优化（例如，施加电压为0.6–1.0 V），而忽略了相关电流的影响，(10?13, 15?17, 19, 21) 或追求更短的电极间距以实现更高的电流密度（0.15–5 A/m2）。(10, 17, 22, 24, 25) 在某些AD系统中（例如，含铁污泥、高盐度有机废水等），由于其高导电性，适当的施加电压可能会引发过大的电流，这可能挑战仅依靠电压调节的方法的有效性，并提出了一个关键问题：电刺激对所有导电性能不同的AD系统都能有效促进甲烷生成吗？因此，在高导电系统中，超越仅电压控制，全面评估电位和电流的影响是必要的，因为它明确了电刺激策略在不同AD系统中的普遍适用性。在这里，我们研究了电刺激策略在处理含铁污泥消化产物的AD系统中提高甲烷生成性能的普遍性。构建了五个施加电压不同的EAD系统，以评估在相同负载条件下有机物转化和甲烷生成性能的变化。进行了全面评估，以确定电位和电流对阳极和阴极生物膜、电化学过程、响应微生物群落结构以及细胞间代谢途径的影响，从而揭示了性能差异背后的内在机制。最终，这项工作强调了从仅依靠电压调节转向电位和电流共同管理的必要性，为高效利用电刺激来改善AD性能提供了有价值的见解。

2. 材料与方法 2.1. 反应器配置 电刺激AD系统由五个相同的丙烯酸圆柱形反应器组成（Φ 9 cm × 20 cm），每个反应器的工作体积为1 L。每个反应器都配备了两块基于聚丙烯腈的碳毡（Beihai Tansu，中国）作为电极材料，单尺寸为10 × 6 cm2，电极间距为5 cm。四个反应器被指定为电刺激组（分别标记为E1.2、E0.9、E0.6和E0.3），施加的直流电压分别为1.2、0.9、0.6和0.3 V，(6) 生成了1.3–5.0 A/m2的中等电流密度。(10, 17, 22) 第五个反应器作为无电压的碳毡对照组，标记为CF。另一个具有相同几何形状但无生物电极的反应器作为传统的AD对照组。所有反应器的示意图见图S1。接种物是从北京门头沟第二再生水处理厂的试验规模设施获得的化学增强初级污泥（CEPS），通过FeCl3絮凝市政废水产生。作为原料的含铁污泥消化产物同样来自该试验工厂，由CEPS和模拟食物废物的共消化产生。原料的主要特性在表S2中详细说明。电化学测量证实，上述系统具有高导电性（离子导电性为1.5–3.0 mS/cm，随有机负荷变化而变化，见图S2）。

2.2. 反应器操作 反应器以顺序批次模式运行，分为两个阶段来研究系统性能和微生物反应。第一阶段作为启动阶段，采用低的OLR进行生物电极适应，并评估电刺激相对于传统AD的 enhancement效果。在此阶段，系统最初在OLR为0.6 g COD/L·d的条件下运行20天，然后提高到1.0 g COD/L·d再运行30天。在第二阶段，实施了逐步增加有机负荷的策略，以确定系统的功能韧性。具体来说，依次施加了五个目标有机负荷，初始tCOD浓度分别为1.5、2.0、2.5、3.0和3.8 g/L（标记为OL 1.5–OL 3.8），每个负荷连续运行两个周期。在OL 3.0和OL 3.8阶段，采集了适量的混合液进行生物化学甲烷潜力（BMP）测试。详细的操作策略见文本S1。在所有批次实验结束后，收集电极生物膜样本进行物理化学和生物化学表征。

2.3. 分析方法 液体样本在分析前通过0.45 μm膜过滤。化学需氧量（COD）、悬浮固体（SS）和挥发性悬浮固体根据标准方法测定。(26) pH值用pH计（METTLER TOLEDO，瑞士）测量。生物气体收集在铝箔袋中。生物气体的体积用玻璃注射器测量。生物气体的组成通过带有热电导检测器的气相色谱法（GC-TCD，7890B，Agilent，美国）测定。甲烷产量是通过将甲烷的比例与生物气体体积相乘来确定的。本文报告的所有甲烷产量数据均已转换为标准温度和压力（STP）条件。生物电极的电位和运行期间的电流使用数字万用表（ShengLi，中国）记录。生物膜采样、形态和组成表征、电化学测试、细胞内蛋白质浓度、细胞内活性氧物种（ROS）、酶分析以及微生物群落和宏转录组分析的详细程序见支持信息。

3. 结果 3.1. 甲烷生成性能：电刺激的有限和可变优势 在第一阶段的低OLR（0.6 g COD/L/d）下，所有组在甲烷产量（152.5–169.4 mL/d）和COD转化率（0.25–0.28 L-CH4/g-COD）方面表现出相似且有利的结果（见图S3）。当OLR增加到1.0 g COD/L/d（第20天）时，所有组都观察到了COD积累和甲烷生成抑制，因为进料酸度导致后进料溶液的pH值降至6.3以下。在所有组中，传统AD反应器受到的影响最为严重，在第31天甲烷产量低于80 mL/d，完全失败。相比之下，电刺激组和CF组逐渐恢复到可比的性能，第31天的甲烷产量增长到约300 mL/d（COD转化率为0.30 L-CH4/g-COD）。这些结果表明，电刺激和导电生物载体都可以减轻COD积累并加速甲烷生成。(10, 13, 16) 为了进一步研究电刺激在导电生物载体之外的效果，在EAD组和对照组CF中引入了逐步增加有机负荷的策略（见图1a,b）。在所有组中，从1.0 g COD/L突然增加到1.5 g COD/L的初始有机负荷引发了严重的酸化冲击（pH ～ 5.6，见图S4），抑制了甲烷生成，使甲烷产量从294.7–318.2 mL/d降低到178.4–238.5 mL/d（见表S3）。随着实验的进行，微生物群落逐渐适应，逐渐减轻了连续负荷冲击的抑制效果。值得注意的是，即使在OL 3.8时，COD降解效率也未受损，进一步证实了这两种增强策略（即电刺激和导电生物载体）在高有机负荷下维持甲烷生成的效果。组间的性能差异遵循两种不同的趋势（见表S3）。在OL 2.5以下，电刺激组的平均COD降解率和甲烷产生率通常高于CF组，其中E0.3的表现优于所有其他组。然而，一旦负荷超过OL 2.5，电刺激的优势逐渐减弱。尽管E0.3仍然是表现最好的电刺激组，但其平均甲烷产生率仅与CF组相当（在OL 3.0时为513.8–522.9 mL/d，在OL 3.8时为481.1–488.6 mL/d），而高电压组（E0.9和E1.2）的甲烷产量分别减少了7.8%（在OL 3.0时）到17.2%（在OL 3.8时）。图1 查看大图下载到幻灯片图1. 第二阶段每个OL的甲烷生成性能：(a) COD去除；(b) 累计甲烷产生；(c) 电位；(d) 电流。图1 查看大图下载到幻灯片图1. 第二阶段每个OL的甲烷生成性能：(a) COD去除；(b) 累计甲烷产生；(c) 电位；(d) 电流。关闭图1。这些结果与之前的研究不同，因为尽管所有施加的电压（和相应的电极电位）都在报告的有效范围内（见图1c），但并未观察到电刺激相对于仅添加导电生物载体的明显优势。这表明，在这个特定的含铁系统中，其他关键因素可能减弱了电刺激的典型增强效果。值得注意的是，在相同的施加电压下，本研究中测量到的电流（10–30 mA，见图1d）显著高于文献中报告的水平（通常为1–10 mA）(10, 17?19)，这是由于系统的电导率升高（见图S2）；因此，过大的电流可能是主要的潜在因素。BMP测试进一步显示，尽管悬浮污泥占总反应器生物量的58.1–63.7%（见图S6），但它对组间甲烷生成性能的差异贡献可以忽略不计（见图S5）。微生物群落分析进一步证实了这一观察（见图S7）。总的来说，这些发现表明，所有反应器之间甲烷生成性能的差异主要归因于电极生物膜的独特性质。

3.2.阳极生物膜的行为与局限性 3.2.1. 通过阳极极化增强电子传递能力 考虑到阳极生物膜主要负责有机物的降解和电子传递，首先对其电子传递能力进行了表征。如CV曲线（图2a，表S4）所示，施加电压较高（即阳极电位更正）的组别显示出更大的电子传递能力，并且所有组别都观察到了明显的氧化还原峰。接近0 mV的氧化峰归因于外膜c型细胞色素（OM c-Cyts）和黄素的结合。(27) 对于还原峰，低电压组（E0.6和E0.3）以及CF组中位于-460至-500 mV之间的峰可以归因于黄素，(28) 而高电压组中接近-370 mV的峰可能归因于OmcB，这与典型的电活性菌属Geobacter的细胞外电子传递（EET）密切相关。(29) CV曲线上与不同电子穿梭相关的峰表明阳极生物膜内部存在耦合的电子传递过程。此外，高电压组表现出更强的DIET取向，这与生物膜中Geobacter的相对丰度显著较高一致（图2b）。此外，关于Geobacter的EET过程（图2c），(30) 在E1.2组中，编码相关蛋白质的多个基因在转录水平上显著上调。(29) 具体来说，编码MacA-PpcA-OmcB/E/S电子传递系统的基因在E1.2组中的表达水平比E0.3组和CF组分别上调了18倍和110倍，而编码e-菌毛的基因表达上调了1.5倍和2.5倍。因此，可以得出结论，更高的阳极电位代表了更强的电极极化，通过调节群落结构和上调关键功能基因的表达增强了生物膜的电子传递能力。这使阳极生物膜能够降解小分子有机物，并将释放的电子转移到阳极上，这也与高电压组在运行过程中观察到的更高电流幅度相符。 图2查看大图下载到幻灯片 图2. 阳极生物膜电子传递能力的增强：(a) 循环伏安法（CV）曲线；(b) Geobacter属的相对丰度；(c) Geobacter中DIET的示意图；(d) 编码参与DIET过程蛋白质的基因表达变化。缩写“A”代表生物阳极，下同。 图2查看大图下载到幻灯片 图2. 阳极生物膜电子传递能力的增强：(a) 循环伏安法（CV）曲线；(b) Geobacter属的相对丰度；(c) Geobacter中DIET的示意图；(d) 编码参与DIET过程蛋白质的基因表达变化。缩写“A”代表生物阳极，下同。 关闭 图2.

3.2.2. 由过量电流引起的氧化应激 然而，更高的阳极电位带来的优异电子传递能力并未转化为更高的甲烷生成性能。随着施加电压的增加，阳极生物膜中的细胞内ROS积累加剧，在E1.2组中达到CF组的2.3倍（图3a），表明高电压组的阳极生物膜受到了持续的氧化应激。相反，超氧化物歧化酶（SOD），一种关键的ROS清除抗氧化酶，其活性随着电压的增加而降低，高电压组仅保留了CF组检测到的SOD活性的23.4–32.4%（图3b）。由于抗氧化防御不足以减轻不断升高的ROS负担，高电压组的细胞膜完整性因此受到损害，这从升高的细胞外乳酸脱氢酶（LDH）活性中得到证实，该活性增加了28.0–55.8%（图3c）。相比之下，阴极生物膜中的ROS和LDH水平没有显著差异，表明氧化应激主要局限于阳极生物膜（图S9）。 图3查看大图下载到幻灯片 图3. 由更高电流引起的更大氧化应激：(a) 细胞内活性氧（ROS）浓度，以CF为标准；(b) 超氧化物歧化酶（SOD）活性；(c) 细胞外乳酸脱氢酶（LDH）活性；(d) 细胞内氧化应激防御系统的示意图；(e) 编码参与氧化应激防御系统蛋白质的基因转录变化；(f) 最大甲烷生成率；(g) 距离控制实验中生物膜的细胞内ROS和细胞外LDH。 图3查看大图下载到幻灯片 图3. 由更高电流引起的更大氧化应激：(a) 细胞内活性氧（ROS）浓度，以CF为标准；(b) 超氧化物歧化酶（SOD）活性；(c) 细胞外乳酸脱氢酶（LDH）活性；(d) 细胞内氧化应激防御系统的示意图；(e) 编码参与氧化应激防御系统蛋白质的基因转录变化；(f) 最大甲烷生成率；(g) 距离控制实验中生物膜的细胞内ROS和细胞外LDH。 关闭 图3. 通常，微生物对抗氧化应激的完整抗氧化网络包括三个主要部分：转录调节、ROS的直接清除和细胞修复（图3d）。(31?33) 在E1.2阳极生物膜中，编码PerR因子的基因在转录水平上显著上调（相对于E0.3组上调1.98倍；相对于CF组上调1.59倍），证实了氧化应激的增加。(34) 这进一步得到了下游关键抗氧化基因如katG、gpx、sod2、ahpC的上调的支持（图3e）。(31) 关于细胞修复，虽然SUF系统的基因转录没有显著变化，但Trx系统的基因在E1.2组中显著上调，trxA相对于E0.3组上调了1.25倍，相对于CF组上调了1.60倍（图3e）。这表明高电压组的蛋白质损伤更为严重。(32, 33) 这 also 解释了较高的sod2转录水平与较低的酶活性之间的明显矛盾：积累的ROS可能氧化了蛋白质中的关键硫醇残基，导致酶的功能失活。(33) 由于高施加电压固有地意味着电极电位和电流幅度的增加，因此进行了一个距离控制实验（文本S8）来分离这两个变量，并确定氧化应激的主要驱动因素。施加电压固定为0.6 V，同时改变电极间距以实现不同的电流幅度。在各组之间未检测到阳极或阴极电位的显著差异（图S11）。结果表明，电流最大的D2组（图S12）在所有有机负荷水平下始终表现出最低的最大甲烷生成率（图3f和S13），同时ROS和LDH水平显著升高（图3g）。这些发现证实电流幅度是导致氧化应激差异的决定性因素。这也解释了为什么以前的研究很少报告显著的氧化应激，因为它们的系统在较低的电流幅度下运行。(10, 17?19)

3.2.3. 由氧化应激驱动的有机降解恶化 最后，研究了阳极生物膜的功能变化。微生物群落分析显示，高电压组中典型发酵细菌（例如，未分类_f_Syntrophobacteraceae、未分类_c_Bacteroidia）的相对丰度明显较低（图4a）。(3) 同时，生物量测定证实更大的氧化应激导致生物膜生物量减少，高电压组的总细胞内蛋白质仅占CF组的70.0–75.1%（图4b），这与图3c中显示的较高细胞外LDH水平一致。因此，功能细菌的绝对丰度降低，从而阻碍了高电压组中将大分子有机物转化为较小中间体的过程。(3) 此外，氧化应激还损害了关键水解酶的活性。E1.2组中的细胞外蛋白酶活性仅为CF组的22.6%，而α-葡萄糖苷酶的活性仅为E0.3组的39.6%（图4c）。转录组分析（图4d）表明，编码与TCA循环、糖酵解和丙酮酸代谢相关蛋白质的基因在E1.2组中显著下调，表明细胞内碳代谢、底物转化和生物合成受到抑制。(12, 35) 有趣的是，参与细胞内蛋白质降解和氨基酸代谢的基因在E1.2组中的转录丰度显著上升。鉴于Clp蛋白酶和Lon蛋白酶是两种典型的依赖ATP的酶，负责降解异常的细胞内蛋白质，(36) 这种上调可能源于氧化性蛋白质损伤（如3.2.2节所讨论的）。这也解释了与CF组相比，E1.2组中F型ATP酶转录本的上调。 图4查看大图下载到幻灯片 图4. 有机降解活性的恶化：(a) 阳极生物膜的微生物群落在属水平上；(b) 通过细胞内蛋白质含量量化的生物量；(c) 水解酶的活性；(d) 编码典型有机降解过程蛋白质的基因表达变化。 图4查看大图下载到幻灯片 图4. 有机降解活性的恶化：(a) 阳极生物膜的微生物群落在属水平上；(b) 通过细胞内蛋白质含量量化的生物量；(c) 水解酶的活性；(d) 编码典型有机降解过程蛋白质的基因表达变化。 关闭 图4. 总而言之，E1.2组中电流引起的氧化应激改变了细胞内的能量分配策略，迫使微生物将有限的代谢能量用于修复损伤和维持细胞稳态。(37, 38) 相比之下，E0.3组中参与TCA循环、ATP合成和丙酮酸代谢的基因显著上调（图4d），反映了适当的电刺激对微生物代谢活性的积极影响。(8, 12) 总之，对于阳极生物膜来说，由过量电流引起的氧化应激不仅减少了功能细菌的绝对丰度，还抑制了正常的代谢活动，从而减缓了大分子有机物的降解，最终损害了整体的甲烷生成性能。

3.3. 阴极生物膜的行为与局限性 3.3.1. 由无机沉积引起的质量传递受限 在EAD系统中，阴极生物膜是甲烷生成的主要场所。(7, 15) 首先，表征了阴极生物膜的形态。SEM显示生物阴极表面有明显的沉积物，随着施加电压的降低，沉积物减轻（图5a），表现为表面孔隙率更高和孔径更大（图S14）。具体来说，四个电刺激组表现出厚度从500到200 μm的不同层，而CF组没有可见的沉积物。EIS分析进一步表明，E1.2组的质量传递阻力是CF组的1.4倍（图5b）。这意味着无机壳层可能阻碍了包括向内物质扩散和向外电子传递在内的双向传输过程，从而抑制了高电压组的阴极甲烷生成。(8)

图5查看大图下载到幻灯片 图5. 由无机沉积引起的质量传递阻力：(a) 通过扫描电子显微镜（SEM）表征的生物膜厚度；(b) 电化学阻抗谱（EIS）谱；(c) 生物膜沉积物中的主要无机元素含量；(d) 沉积物中的固定CO2量和阴极微环境pH；(e) X射线衍射鉴定沉积物的主要成分；(f) 沉积层厚度与影响电位因素之间的相关性分析（*p < 0.1, **p < 0.05）。缩写“C”代表生物阴极，下同。 图5查看大图下载到幻灯片 图5. 由无机沉积引起的质量传递阻力：(a) 通过扫描电子显微镜（SEM）表征的生物膜厚度；(b) 电化学阻抗谱（EIS）谱；(c) 生物膜沉积物中的主要无机元素含量；(d) 沉积物中的固定CO2量和阴极微环境pH；(e) X射线衍射鉴定沉积物的主要成分；(f) 沉积层厚度与影响电位因素之间的相关性分析（*p < 0.1, **p < 0.05）。缩写“C”代表生物阴极，下同。 关闭 图5. 为了阐明无机沉积的潜在机制，分析了沉积层的物理化学性质。Fe、Ca、Mg、P和S被确定为主要的无机元素（图5c），这与SEM-EDS映射结果一致（图S15）。尽管Fe在所有组中的浓度最高（图5c）并形成了vivianite（图5e），但它不是导致厚度变化的主要因素（图5f），这与CF组中没有沉积层的事实相符。Ca含量在不同组之间存在显著差异，趋势为：高电压组（13.7%）> 低电压组（11.7%）> CF组（4.8%）（图5c）。相关性分析进一步显示，在金属阳离子中，只有Ca与厚度有显著的正相关性，表明钙沉积是组间差异的决定性因素（图5f）。此外，固定CO2水平随着施加电压的增加而增加（图5d）。这归因于阴极电位的降低（图1c），这触发了生物电极微环境内的局部碱化——从CF组的pH 7.0增加到E1.2组的pH 8.0（图5d）。这种碱性的变化有利于碳酸根离子的形成，这些碳酸根离子与Ca、Mg和Fe反应，在电极上形成矿物沉淀（图5e）。(39) pH值与二氧化碳固定之间的显著正相关性进一步证实了碳酸根是无机基质中的主要阴离子。此外，电流大小和阴极电位也被证实是控制沉积厚度的重要因素。3.3.2. 通过低电压刺激促进的产甲烷活性 电刺激对阴极生物膜中的产甲烷菌显示出显著的富集效应。随着施加电压的增加，Euryarchaeota的相对丰度从E0.3组的1.3%上升到了E1.2组的25.8%，高于CF组的0.9%（图6a）。此外，电刺激组产生的辅酶F420和甲基辅酶M还原酶（Mcr）也比CF组显著更多（图6b）。转录组分析证实了这些发现，显示在低电压刺激下，编码产甲烷酶的一系列基因的转录水平显著上调（图6d）。(12) 对于二氧化碳还原途径，所有关键基因在E0.3组都表现出显著的上调，其倍增减幅从2.55到15.1不等，与CF组相比。同时，共同途径中的多个基因，包括Mcr，在E0.3组显示出最高的转录水平。同样，E0.6组在其他途径中的几个关键基因上也保持了最高的转录水平，例如参与乙酸裂解途径的ack基因和甲基营养途径的mtaA基因。在三种产甲烷途径中，与乙酸裂解途径相关的基因表现出更高的转录丰度，这与Methanosaeta在阴极生物膜中的优势一致（图S16），表明乙酸裂解产甲烷是该系统中的主要途径。(3) 图6查看大图下载到幻灯片图6. 低电压刺激下促进的产甲烷活性：(a) 阴极生物膜中Euryarchaeota的相对丰度；(b) 辅酶F420和甲基辅酶M还原酶（Mcr）的浓度；(c) 编码细胞代谢和乙酸生成的基因的表达变化；(d) 编码产甲烷的基因的表达变化。图6查看大图下载到幻灯片图6. 低电压刺激下促进的产甲烷活性：(a) 阴极生物膜中Euryarchaeota的相对丰度；(b) 辅酶F420和甲基辅酶M还原酶（Mcr）的浓度；(c) 编码细胞代谢和乙酸生成的基因的表达变化；(d) 编码产甲烷的基因的表达变化。关闭图6. 关于细胞代谢和乙酸生成，相关基因在低电压组中也表现出显著的转录上调，例如与ATP合成相关的基因以及参与丙酸和丁酸代谢的基因（图6c）。(12) 因此，低电压组具有更高的乙酸生成能力，这增强了底物供应速率，从而促进了产甲烷过程。这些系统变化表明，低电压刺激在转录和翻译层面上有效增强了阴极生物膜的产甲烷能力。然而，观察到的放大效应表明，高效的质量传递是EAD系统性能提升的基本前提。这一潜在的限制因素在高导电性EAD系统的长期运行中需要特别注意。4. 讨论 4.1. 电刺激对阳极生物膜的影响：电位和电流的综合效应 在EAD系统中，电刺激对阳极生物膜功能的影响主要体现在增强电子传输能力上。(5, 7, 40) 具体来说，最佳的阳极电位可以诱导电活性细菌（例如Geobacter）的富集，从低于3%增加到超过20%，这些细菌通过导电的菌毛或细胞色素C建立高效的IET。(17, 40, 41) 这种效率的提升加快了底物向乙酸的转化以及产甲烷所需的电子传输过程，从而缩短了滞后阶段并增加了甲烷产量。(12, 17) 然而，这种促进效应主要在低导电性系统中得到报道（例如市政废水），在这些系统中，响应电流仍然较低。(10, 17?19) 在这些系统中，除了增强电子传输能力外，还实现了正面的代谢收益，同时保持了可忽略的氧化应激。相反，由于本研究中含铁系统的高导电性，在中等施加电压下会触发过大的电流，从而导致阳极生物膜受到显著的氧化应激（图3）。值得注意的是，好氧细菌对高电流或导电性的耐受性差异很大。(42) 对于发酵细菌，过量电流引起的氧化应激可能导致细胞内电子过载，从而产生能量过剩，进而破坏氧化还原平衡。(43) 同时，ROS的积累可能抑制细胞代谢并干扰代谢酶的转录和翻译。(18) 此外，氧化应激可能调节细胞信号传导和增殖，例如通过激活与微生物应激防御和凋亡紧密相关的氧化还原敏感途径。(44) 因此，在高导电性EAD系统中，电刺激表现出双重效应：合适的阳极电位促进了极化和电子传输，而伴随的高电流则对微生物群体造成了不可忽视的结构和功能损害。值得注意的是，尽管本研究中的绝对电流值显著超过了以往的研究，但面积归一化的电流密度仍然相当。(10, 17, 22) 这表明这种电流密度不能准确反映微生物实际经历的局部电刺激。因此，在评估电流引起的抑制作用时，总电子通量（由绝对电流表示）也很关键。由于生物膜的空间异质性，高电流可能会引起局部氧化应激，从而损害生物活性，即使平均电流密度看起来适中。(45) 4.2. 电刺激对阴极生物膜的影响：高电流通过增强质量传输和阴极反应来加速动力学 运用外加电位，电子通过外部电路从阳极传输到阴极，在那里被包括嗜氢产甲烷菌、电活性细菌和水分子在内的竞争性电子受体利用。(7, 15) 嗜氢产甲烷菌可以直接接受电子将CO2还原为甲烷，(13) 而具有DIET能力的电活性细菌可以作为电子媒介，将电子转移到乙酸裂解产甲烷菌进行CO2还原。(46) 此外，在我们的研究中，铁离子也充当潜在的电子受体（图S17）。电子的积累改变了电极的表面电荷密度，引发了系统中水分子或离子的迁移。(47) 随后的电化学还原作用生成OH–。这些物理化学过程发生在纳秒到皮秒的时间尺度上，(47, 48) 比微生物过程快几个数量级。在低电流系统中，有限的电子通量减弱了这种明显的动力学差异，导致表面电荷密度变化小，OH–生成量少，离子迁移受限。因此，无机沉积过程缓慢进行，使得微生物能够在阴极有效竞争电子。然而，当电流变大时，增加的电子通量生成更多的OH–，将更多的溶解无机碳转化为CO2–3，同时加速了Ca2+或其他离子的迁移。(39, 49) 这种加速导致无机矿物（如碳酸盐）在阴极表面大量沉积，最终阻塞了向微生物的电子流动（图5）。这解释了为什么在我们的系统中观察到大量的方解石，尽管Ca2+浓度（20–130 mg/L）与其他研究相当。(50) 相关性分析还证实，高电流通过诱导pH值变化促进了无机沉积，这主要调节了 scaling层的形成和随后的质量传递阻力（图5）。鉴于乙酸裂解途径是系统中的主要途径，并且考虑到与CO2利用无关的代谢过程也显示出阴极电位和表达丰度之间的明显正相关（图6c），很明显，方解石 scaling层主要通过施加严重的质量传递阻力而不是限制CO2底物的可用性来抑制阴极产甲烷。4.3. 环境影响 本研究评估了在含铁污泥消化物处理的EAD系统中，电刺激增强产甲烷（AD）的必要性和可行性。虽然特定的操作模式可以提高甲烷产量，但相关的能耗和系统维护成本表明，添加导电材料（例如碳毡）可能仍然是一个极具竞争力的替代方案。例如，在连续流动模式下，低电压组比CF组表现出更好的韧性，在高OLR（3.25 g COD/L·d）下实现了稳定的甲烷产量；然而，通过比较甲烷的增量能量输出与非刺激组的电能输入，发现前者并不总是能够抵消后者（表S5，图S19）。鉴于其在富集功能性微生物群体方面的独特优势，电刺激策略在增强AD方面仍具有巨大潜力。然而，考虑到某些废物流（例如含铁污泥、高盐度有机废水等）的内在高导电性可能会引发过大的电流响应和随后的不利影响，因此需要从经验性的仅电压调节向精确的电位和电流联合管理进行根本转变。基于这种联合管理的概念，可以设想几种创新的操作模式。利用生物电化学系统进行预适应，然后将成熟的生物膜部署到载体上投入使用，可能充分利用专门化社区的优势，同时避免长期电刺激相关的问题。同样，间歇性电刺激可能提供一个有前景的折中方案。未来的研究可以关注电刺激和导电材料补充在增强AD方面的相似性和差异性，包括表征界面物理化学性质，量化DIET和MIET各自的贡献，以及追踪两种增强策略下的微生物群落组装过程。总之，电刺激不应仅仅被视为一种简单的提高甲烷产量的工具，而应作为一种精确的生物增强策略。通过向合理的电位和电流联合管理方向发展，电刺激辅助AD技术有望开辟一条新的碳中和路径，实现高效率与低能耗的平衡，适用于各种AD系统，以实现能源和资源的回收。