邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯通过靶向α-突触核蛋白二聚化诱导小胶质细胞向M1亚型转化致神经毒性

《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Di-2-ethylhexyl Phthalate Induces Neurotoxicity of Transforming Microglia into M1 Subtype through Targeting α-Syn Dimerization

　　

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摘要

邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）在食物链中累积，威胁人类和动物健康。然而，DEHP如何通过对小胶质细胞的干扰引起神经毒性尚未完全阐明。本研究旨在探索DEHP对小胶质细胞的影响，并确定导致神经毒性的相关靶标。研究结果表明，DEHP损伤神经元，导致肿胀、脱髓鞘和自噬异常。抑制自噬导致α-Syn错误折叠，表现为随添加剂浓度增加二聚体比例增加（P = 0.0096）。添加剂的加入促进了二聚体的形成，增大了静电力，并增强了Glu106、Gly51和Val66之间的相互作用。从神经元传递至小胶质细胞（Pearson r2 = 0.889），DEHP暴露下的病理性聚集体诱导小胶质细胞M1亚型转换。本研究阐明了DEHP损害鸟类神经系统的新型机制，并为通过食物链传递的塑料添加剂引起的神经毒性疾病风险提供了治疗靶标。

1. 引言

全球塑料滥用的加剧已导致环境中碎片垃圾的大量增加。(1, 2) 塑料碎片通过光氧化、生物、化学和机械过程降解，并已渗透至全球环境，包括极地地区和众多陆地栖息地。(2) 近期研究发现，70%的添加剂可能因风化而释放到环境中，其中DEHP在流量期内最为显著。(3) 美国环境保护署（EPA）已将DEHP列为优先污染物。(4) DEHP可污染动物、农作物甚至海洋生物，最终通过食物链进入人体，(5) 最终危害人类健康。(6) 研究表明，产前DEHP暴露会负面影响儿童的神经发育。(7) 产前DEHP代谢物水平与儿童自闭特质评分增加相关。(7) 多种细胞机制参与DEHP引起的神经毒性，包括氧化应激、Nrf2通路、线粒体功能障碍和细胞凋亡。(8) 对人体尿液和饮食的冗余分析显示，饮食占尿液DEHP的33.6%，肉类、禽类、高蛋白食品和主食是主要贡献来源。累积风险评估显示，7.3%的个体超过了安全阈值，主要归因于DEHP。(9) DEHP不仅是环境污染物，也是与食品安全直接相关的饮食暴露因素。尽管在食品和农业相关环境中的暴露与风险评估框架相对完善，且越来越多研究关注DEHP造成的脑损伤，但DEHP引起的神经毒性的靶标仍存在许多值得探索的空白。小胶质细胞作为神经系统的巨噬细胞，通常保持静息状态（M0）并进行免疫监视。(10) 小胶质细胞通过监测微环境、吞噬死亡细胞或碎片、修剪突触和产生神经营养因子来维持中枢神经系统（CNS）平衡。(11) 一旦发生应激，小胶质细胞迅速从监视状态转换为"激活"状态，导致其向M1和M2表型极化。(10, 12) 激活后，M1小胶质细胞释放TNF-α和IL-1等促炎因子，导致神经元死亡、阻碍轴突再生并诱导脱髓鞘。(13) 相比之下，M2小胶质细胞通过释放IL-4、IL-6和IGF-1等抗炎因子来增强神经元存活、轴突生长、髓鞘化和突触发育。(14, 15) 高度可塑的小胶质细胞对局部微环境中的各种刺激表现出促炎表型（M1）与抗炎表型（M2）之间的动态平衡。(16) α-Syn是一种含有140个残基的小蛋白，在哺乳动物细胞中本质上无序。(17) α-Syn肽的积累是神经退行性疾病的重要病理标志。(18) 尽管α-Syn聚集体的神经元起源众所周知，但其对小胶质细胞的直接影响，特别是对不同小胶质细胞亚群的影响，仍知之甚少。阐明这种交互作用对于理解小胶质细胞亚型分化引起的神经毒性机制至关重要，并将有助于填补该领域的重要空白。在生态系统的食物链中，鸟类是不可替代的。鸟类常被用作污染物影响的指示物种。由于鸟类处于较高营养级，容易积累污染物，能够迁徙，且与人类食物相关，污染物可能通过鸟类在生态系统中积累并进一步进入人类食物链，成为需要特别关注的风险途径。雄性日本鹌鹑是评估鸟类毒性的公认模型。本研究选择日本鹌鹑作为模式物种，研究塑料添加剂对这些鸟类的影响。本研究确定了DEHP诱导的小胶质细胞亚型和攻击神经系统的靶标。具体而言，通过实验室研究发现DEHP损伤神经元，包括肿胀、脱髓鞘和自噬异常。自噬功能被抑制，导致α-Syn错误折叠，表现为二聚体比例随添加剂浓度升高而增加。添加剂增强了静电力，同时增加了Glu106、Gly51和Val66之间的相互作用，促进二聚体形成。疾病相关蛋白聚集体作为响应诱导小胶质细胞向M1亚型转换。本研究不仅阐明了DEHP损害鸟类神经系统的新型机制，还填补了食物链暴露与人类健康风险之间的毒理学空白。这些结果为农业与食品化学和毒理学研究提供了机制支持。

2. 材料与方法

2.1 实验动物与设计

雄性日本鹌鹑是评估鸟类毒性的公认模型。(19) 本研究选择日本鹌鹑作为模式物种，研究塑料添加剂对这些鸟类的影响。雄性鹌鹑（Coturnix japonica，8日龄，体重26.7 ± 2.4 g）购自万嘉农场（中国哈尔滨）。DEHP（C??H??O?，CAS：117-81-7，>99.0%）购自上海阿拉丁生化科技有限公司。东北农业大学伦理委员会批准了实验程序，遵循实验室动物照顾和使用指南（NEAUEC20200346）。根据我们实验室的先前研究，建立了DEHP梯度。经过7天适应期后，鹌鹑被随机分为五组（n = 60），每组12只：Con组（0 μg/kg BW/day DEHP和饮水）、Von组（0 μg/kg BW/day DEHP和玉米油）、D250组（250 μg/kg BW/day DEHP）、D500组（500 μg/kg BW/day DEHP）和D750组（750 μg/kg BW/day DEHP）。据报道，土壤中DEHP浓度范围为1至264 mg/kg。(20) 鸟类食物摄入量：CRFood,raw = 0.0582(BWkg)^0.651 (kg/d)。(21) 鸟类在自然环境中的土壤摄入率：CRsoil = 0.18 × CRFood,raw。(22) 在本实验26.7 ± 2.4 g的体重范围内，CRsoil ≈ 0.00060–0.00065 kg/d。将土壤DEHP浓度（1–264 mg/kg）代入剂量换算，鹌鹑每日DEHP摄入剂量约为23.5 × Csoil（μg/kg BW/day）。因此，与250–750 μg/kg BW/day实验剂量相对应的土壤浓度约为10.6–31.9 mg/kg，表明所选剂量覆盖了与环境浓度水平一致的暴露场景。EFSA邻苯二甲酸酯评估中的组TDI（以DEHP表示）为50 μg/kg BW/day，常用作参考值。(23) 为增强统计效应和机制可检测性，本研究使用了高于阈值的剂量梯度，250–750 μg/kg BW/day约为DEHP组TDI（50 μg/kg BW/day）的5–15倍。本研究的目的是建立DEHP暴露水平的剂量-效应/机制相关性和毒理学反应。本研究的结论应作为DEHP的毒理学证据来解读，在从生态学角度推断吸收和代谢效率时仍需谨慎。经过45天DEHP暴露后，鹌鹑禁食12小时后用二氧化碳安乐死。随后，精确解剖大脑并在?80 °C保存以供进一步分析。

2.2 组织病理学评估

收集的大脑组织固定在10%甲醛中，包埋于石蜡，然后用苏木精-伊红（H&E）、尼氏染色和 Luxol 快速蓝（LFB）染色分别进行染色。鹌鹑大脑组织的尼氏染色按先前发表的方法进行。(24) 简要而言，连续切片用0.75%硫代托吡蓝染色，经梯度乙醇（70、95、100%各2次）脱水，置于二甲苯中，用DPX封片剂封片。将5 μm厚的视觉大脑组织切片在室温下用0.1% Luxol 快速蓝（LFB；Sigma-Aldrich）溶液染色过夜，切片在95%乙醇中冲洗，用蒸馏水清洗，放入70%酒精中10分钟，随后用蒸馏水清洗。然后，切片在结晶紫工作液中复染15秒，再依次在95%和100%乙醇中脱水，在二甲苯中分化直至无背景色。用光学显微镜观察切片。每组随机选取6个大脑进行半定量盲法计数神经元。

2.3 透射电子显微镜（TEM）观察

将近似1 mm3的大脑组织在4 °C下用2.5%戊二醛固定3小时。这些组织块用0.1 M pH 7.2 PBS洗涤，再用锇酸固定2小时。组织脱水和Araldite包埋后，用醋酸镁-铀进行超薄切片染色。最后，用透射电子显微镜（TEM，H-7650，Hitachi Limited，东京，日本）观察切片。每组随机选取3个大脑进行半定量盲法电子显微镜取样。

2.4 免疫印迹和Native PAGE

蛋白定量使用商业试剂盒（Beyotime Institute of Biotechnology，中国）。从大脑组织（100 mg）中提取总蛋白，使用RIPA缓冲液。等量蛋白提取物经12%和10% SDS-PAGE分离后电转移至硝酸纤维素膜（NC）（Biosharp，中国合肥）。然后，膜在TBST（含20%甲醇和0.05% Tween-20的Tris-甘氨酸缓冲液）中洗涤并用5%脱脂牛奶封闭1小时。膜与不同多克隆抗体在4 °C下孵育过夜。然后，膜用TBST洗涤5次，每次5分钟，与二抗（ZSGE-BIO，中国北京）在37 °C下孵育1小时。最后，膜再次用TBST洗涤5次，每次5分钟。蛋白表达以β-actin水平标准化。使用GE Amersham Imager 600（GE，美国）通过化学发光显影蛋白条带。电泳条带的灰度分析使用ImageJ软件程序进行。详细抗体信息见支持材料表S1。使用半定量盲法从每组随机选取3个大脑进行Western blotting。

2.5 模型构建与计算

使用分子动力学（MD）方法对生物分子系统进行时间演化的建模，包括α-Syn二聚体、DEHP-α-Syn二聚体和MEHP-α-Syn二聚体。对于结合自由能计算，我们使用了GMX-MMPBSA方法。(25) 使用Gromacs 2019软件进行复合物的分子动力学模拟。(26) 详细信息见支持材料表S2。

2.6 免疫荧光（IF）

用免疫荧光对大脑组织进行染色以共定位IBA-1、NeuN和α-Syn。脱蜡后使用梯度乙醇系列对石蜡包埋组织切片进行复水。详细处理方法见支持信息方法1.1。详细抗体信息见支持材料表S1。每组随机选取6个大脑进行半定量盲法免疫荧光染色。

2.7 细胞培养

人小胶质细胞克隆3（HMC3）细胞在含10%胎牛血清的MEM培养基中培养（CM-0583，Procell）（TCH-C399）（Hycyte Biotechnology，中国苏州）。每3天换液一半。细胞在37 °C、含5% CO?的湿润环境中培养。

2.8 CCK-8检测

为确定DEHP和MEHP对体外细胞增殖的影响，使用CCK-8检测评估不同浓度DEHP和MEHP对神经元增殖的影响。

简而言之，我们将 100 升细胞悬液接种到 96 孔板中，并在 24 小时后以 0、50、100、200、300、400 和 500 μmol/L 的浓度加入 DEHP/MEHP。在每孔中，细胞培养 24 小时后加入 10 μL CCK-8（C0037，Beyotime，上海）并孵育 2 小时。测量 450 nm 处的吸光度，并计算不同处理组的增殖率。根据测量结果，实验分为三组：Con 组（0 μM DEHP）、D50（50 μM DEHP）和 M50（50 μM MEHP）。

2.9. 统计分析

ImageJ 用于分析免疫印迹数据和共定位相关数据（ImageJ）。在进行单因素方差分析之前，使用夏皮罗 - 威尔克检验（Shapiro–Wilk test）评估数据正态性，并使用勒文检验（Levene's test）评估方差齐性。使用 GraphPad Prism 软件（GraphPad Software）进行单因素方差分析（ANOVA）。图表代表至少三次独立实验的平均数据，表示为均值 ± 标准差（SD）。在所有定量分析中，将 DEHP 处理组与 Vcon 组进行比较。为了便于阅读，显著性仍用 *（P < 0.05）、**（P < 0.01）和 ***（P < 0.001）表示，表示与 Vcon 组相比的差异，但确切 p 值已在结果中提供。

3. 结果

3.1. DEHP 暴露下的神经元病理变化

DEHP 是脱落率最高且具有强生物毒性的添加剂。(27) 我们使用鹌鹑进行研究，以调查 DEHP 的危害（图 1A）。使用 H&E、尼氏染色和银染估算脑结构分析（图 1B）。结果显示，DEHP 处理组的神经元与 Con 组和 Vcon 组不同。在 Con 组和 Vcon 组中，神经元的形态和密度正常，表现出锐利的边缘和多边形形状（图 1C）。然而，随着 DEHP 浓度的增加，观察到树突可能会缩短甚至消失，范围从神经元丢失到细胞肿胀和变形（图 1C）。D750 组的损伤更为严重。增加的 DEHP 剂量降低了神经元密度，同时增加了面积（图 1D；Pearson r = ?0.52，P = 0.003）。
图 1 查看大图 下载至幻灯片 图 1. DEHP 暴露下的神经元损伤。(A) 研究 DEHP 对鹌鹑神经毒性的实验过程示意图。(B) 尼氏染色、H&E 和银染后的观察和定量位置。(C) 纹状体组织学变化的代表性图像。(D) H&E 染色的神经元数量和面积大小定量 (n = 6)。(E) 使用尼氏染色定量数量与面积的关系 (n = 6)。组间差异的显著性符号：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
图 1 查看大图 下载至幻灯片 图 1. DEHP 暴露下的神经元损伤。(A) 研究 DEHP 对鹌鹑神经毒性的实验过程示意图。(B) 尼氏染色、H&E 和银染后的观察和定量位置。(C) 纹状体组织学变化的代表性图像。(D) H&E 染色的神经元数量和面积大小定量 (n = 6)。(E) 使用尼氏染色定量数量与面积的关系 (n = 6)。组间差异的显著性符号：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
关闭图 1.
尼氏体是神经元功能状态的标志。(28) 本研究发现，暴露浓度增加导致尼氏体物质丢失（图 1C）。DEHP 暴露的脑组织表现出尼氏体从 D250 组到 D750 组逐渐减少（图 1D；Pearson r = ?0.78，P = 4.0 × 10–7）。此外，颜色变浅，蓝色强度在 D750 组中下降最为显著。综合这些结果，可以指出 DEHP 损伤了纹状体神经元。

3.2. DEHP 暴露诱导神经元脱髓鞘并抑制自噬流

髓鞘是神经系统的特化结构，既能增强电传导，又能保护神经元免于退化。(29) 髓鞘保护轴突，保持其环境和功能。(30) 许多炎症和神经退行性疾病以脱髓鞘为特征。(31) 正如预期的那样，受伤神经元的髓鞘发生了结构变化（图 2A）。在本实验中，LFB 染色显示严重脱髓鞘，表现为与 Vcon 组相比，D500 和 D750 组髓鞘染色丢失、空泡化以及密度降低（图 2B；P < 0.01）。电子显微镜进一步表明，髓鞘中发现层间空间扩大，且在 DEHP 暴露组中观察到典型的自噬体（图 2C）。基于这些现象，决定检测参与脱髓鞘和自噬的相关分子的变化。与 Vcon 组相比，D500 和 D750 组中 AKT（P = 0.0029）和 PI3K（P = 0.0148）的表达显著上调（图 2D）。与 Vcon 组相比，D500（P = 0.0149）和 D750 组（P = 0.0006）中 mTOR 的含量显著降低。在 D750 组中发现 Lc3bII/Lc3bI 比值（P = 0.0148）、Beclin1（P = 0.0004）和 p62（P = 0.0333）显著增长。然而，未观察到自噬体被溶酶体吞噬。(32) 结果表明，DEHP 可导致髓鞘结构损伤并激活自噬体形成，但自噬流受阻。在神经元依赖性自噬溶酶体途径受阻的情况下，各种蛋白质会错误折叠。(33)

图 2 查看大图 下载至幻灯片 图 2. 邻苯二甲酸盐引起的脱髓鞘和自噬。(A 和 B) 使用 LFB 染色检测脱髓鞘 (n = 6)。(C) 脱髓鞘和自噬的电子显微镜视图。(D) 与脱髓鞘和自噬相关的分子变化。红色箭头表示自噬体，绿色箭头表示脱髓鞘。(E) 自噬和脱髓鞘相关蛋白表达定量 (n = 3)。组间差异的显著性符号：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
图 2 查看大图 下载至幻灯片 图 2. 邻苯二甲酸盐引起的脱髓鞘和自噬。(A 和 B) 使用 LFB 染色检测脱髓鞘 (n = 6)。(C) 脱髓鞘和自噬的电子显微镜视图。(D) 与脱髓鞘和自噬相关的分子变化。红色箭头表示自噬体，绿色箭头表示脱髓鞘。(E) 自噬和脱髓鞘相关蛋白表达定量 (n = 3)。组间差异的显著性符号：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
关闭图 2.

3.3. DEHP 激活小胶质细胞并将其转化为促炎表型 M1

小胶质细胞有静息状态和激活状态，激活状态表现为两种形式：促炎表型和抗炎表型。(34) 为了调查 DEHP 对小胶质细胞的影响，我们对小胶质细胞进行了免疫荧光检测。小胶质细胞标记物的荧光结果显示，Con 组和 Vcon 组中的小胶质细胞具有高度分支的突起向外延伸（图 3A,B）。DEHP 处理组中小胶质细胞的突起缩短，随着 DEHP 剂量的增加，细胞体增大且突起变短（图 3C；D500：P = 0.0005；D750：P < 0.0001）。与对照组相比，D750 组中 TNF-α（P = 0.0088）和 IL-1β（P = 0.0225）蛋白的表达水平显著增加（图 3E）。相反，IL-10 的表达水平显著降低（图 3E；P = 0.0005）。D500（P = 0.0003）和 D750（P = 0.0008）组中 IBA-1 的表达水平显著增加（图 3E）。这些结果表明，DEHP 暴露激活小胶质细胞进入 M1 促炎表型。
图 3 查看大图 下载至幻灯片 图 3. DEHP 激活小胶质细胞进入 M1 促炎表型。(A) DEHP 激活小胶质细胞的示意图。(B) 小胶质细胞标记物 IBA-1 的免疫荧光染色。(C) 从每个组的不同视野中随机选择三个小胶质细胞进行面积定量分析 (n = 3)。(D) 抗炎和促炎因子的 Western blotting 结果。(E) TNF-α、IL-1β、IL-10 和 IBA-1 蛋白表达的定量结果。统计数据表示为均值 ± 标准差 (n = 3)。组间差异的显著性符号：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
图 3 查看大图 下载至幻灯片 图 3. DEHP 激活小胶质细胞进入 M1 促炎表型。(A) DEHP 激活小胶质细胞的示意图。(B) 小胶质细胞标记物 IBA-1 的免疫荧光染色。(C) 从每个组的不同视野中随机选择三个小胶质细胞进行面积定量分析 (n = 3)。(D) 抗炎和促炎因子的 Western blotting 结果。(E) TNF-α、IL-1β、IL-10 和 IBA-1 蛋白表达的定量结果。统计数据表示为均值 ± 标准差 (n = 3)。组间差异的显著性符号：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
关闭图 3.

3.4. 在 DEHP 暴露下，α-Syn 从神经元传递至小胶质细胞

α-Syn 是一种丰富的神经元蛋白，主要定位到突触前末梢，并参与突触囊泡的周转和兴奋性神经递质的释放。(35, 36) 在哺乳动物自噬受抑时，α-Syn 会发生结构变化，发现其与自噬和 Akt/mTOR 通路相关。(37, 38) 为了检测神经元和小胶质细胞之间的串扰，我们对标记物（NeuN、IBA-1 和 α-Syn）进行了免疫荧光共定位检测。IBA-1（绿色荧光）和 α-Syn（黄色荧光）的 Pearson 相关分析显示，Con 组和 Vcon 组的 Pearson 相关系数分别为 0.149 和 0.168（图 4A）。然而，随着 DEHP 的增加，相关系数在 DEHP 处理组中分别增加到 0.402、0.577 和 0.889（图 4A）。结果表明，与 Con 和 Vcon 相比，随着 DEHP 剂量的增加，α-Syn 与小胶质细胞的共定位增加（图 4A,B）。这一结果表明 α-Syn 可以从神经元转移至小胶质细胞（图 4C）。通过非变性 PAGE 显示，α-Syn 有三种不同的折叠形式：单体、二聚体和多聚体（图 4D）。在不同程度的 DEHP 处理下，鹌鹑中单体 - 二聚体和四聚体的总和没有显著差异。然而，随着 DEHP 水平的变化，不同寡聚体的含量动态变化。在 Con 组和 Vcon 组中，单体表达低于 D750 组（图 4D；P = 0.0319）。DEHP 处理组（D250：P = 0.7891；D500：P = 0.1121；D750：P = 0.0847）和 Vcon 组之间四聚体的表达没有显著变化（图 4D）。二聚体的高表达在 D500（P = 0.0096）和 D750 组（图 4D；P = 0.0098）。
图 4 查看大图 下载至幻灯片 图 4. DEHP 暴露下神经元和小胶质细胞之间的串扰。(A) 对神经元标记物（NeuN）、小胶质细胞标记物（IBA-1）和 α-Syn 进行免疫荧光染色。(B) NeuN、IBA-1、α-Syn 荧光强度和位置定量。Pearson 相关分析重点关注 IBA-1（绿色荧光）和 α-Syn（黄色荧光）之间的相关性。(C) DEHP 暴露下神经元和小胶质细胞之间串扰的示意图。(D) 体外培养小胶质细胞（HMC3）的免疫荧光和 α-Syn 蛋白免疫荧光检测。(E) α-Syn 构象检测。统计数据表示为均值 ± 标准差 (n = 3)。组间差异的显著性符号：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
图 4 查看大图 下载至幻灯片 图 4. DEHP 暴露下神经元和小胶质细胞之间的串扰。(A) 对神经元标记物（NeuN）、小胶质细胞标记物（IBA-1）和 α-Syn 进行免疫荧光染色。(B) NeuN、IBA-1、α-Syn 荧光强度和位置定量。Pearson 相关分析重点关注 IBA-1（绿色荧光）和 α-Syn（黄色荧光）之间的相关性。(C) DEHP 暴露下神经元和小胶质细胞之间串扰的示意图。(D) 体外培养小胶质细胞（HMC3）的免疫荧光和 α-Syn 蛋白免疫荧光检测。(E) α-Syn 构象检测。统计数据表示为均值 ± 标准差 (n = 3)。组间差异的显著性符号：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
关闭图 4.

HMC3细胞系保留了人源小胶质细胞的关键生物标志物（如CD68、CD11b、IBA-1）和典型的免疫应答功能，使其成为目前精细化分子机制分析的最佳替代工具。(39) α-Syn蛋白的序列比对结果显示，人类和鹌鹑来源的同源性为86%（图S1）。通过功能结构域分析发现，执行功能的结构在人类和鹌鹑中高度保守。更重要的是，鹌鹑和人类中形成二聚体的氨基酸位点相同，且体外观察到的表型变化（人源细胞）和体内观察到的变化（鹌鹑组织）高度一致（图S1）。CCK-8实验结果显示，当DEHP和MEHP的浓度为50 μM时，细胞存活率存在显著差异（图S2）。在体外，HMC3在D50和M50组中被激活，表现出典型的变形虫样形态（图4E；白色箭头指示被激活的小胶质细胞）。之前的结果表明，DEHP的出现导致自噬流受阻和自噬体的出现，从而导致蛋白质错误折叠。为探究α-Syn的结构变化是否由自噬抑制引起，在HMC3中加入了自噬激动剂雷帕霉素。结果显示，加入雷帕霉素后α-Syn的免疫荧光强度降低（图4E）。这表明自噬抑制是α-Syn异常聚集的主要原因。随后，向D50和M50组中加入了α-Syn聚集抑制剂，如盐酸Synucleozid。结果显示，拮抗α-Syn聚集可减轻小胶质细胞激活并恢复其正常形态（图4E）。此外，向正常组中加入外源性α-Syn蛋白可诱导小胶质细胞极化（图4E）。这些结果表明，DEHP抑制自噬流，导致α-Syn蛋白错误折叠并激活小胶质细胞。抑制α-Syn蛋白的错误聚集可减轻小胶质细胞激活，推测α-Syn蛋白的二聚化可能是DEHP诱导小胶质细胞神经毒性的关键。

3.5. 使用AlphaFold模拟α-Syn二聚体

AlphaFold系统已被用于提高结构预测的准确性。(40) 首先，通过AlphaFold模拟了一组五个二聚体结构（图5A）。其中，模型5显示了更多的蓝色部分，意味着蛋白内氨基酸对的错误率最低（图5B）。模型5的置信度也最高（图5B）。输入氨基酸序列与数据库中已知序列的比对结果也显示了高度一致性。具体而言，序列比对准确性越高，颜色越蓝（图5C,D）。总之，这些发现表明模型5具有最高的蛋白二聚体结构概率。值得探讨DEHP如何影响该模型中的二聚体形成。需要注意的是，预测的二聚体模型仅作为分子动力学模拟的结构输入，不能替代通过实验直接表征真实聚集体形态/构象。图5 α-Syn二聚体模拟。（A）使用AlphaFold系统创建的五个α-Syn模拟二聚体。（B）五个模型的拟合精度。（C）输入氨基酸序列与数据库中已知序列的比较结果。横轴为氨基酸位点，纵轴为每个氨基酸位点成功比对的已知序列数量。每条彩色水平线代表一条已成功比对的已知序列，覆盖参考纵轴的氨基酸位点。右轴的颜色代表已成功比对的已知序列的一致性，颜色越蓝，一致性越高。（D）五个模型中每个位点的预测LDDT值。

3.6. DEHP和MEHP促进α-Syn二聚体的形成

分子动力学模拟可精确探测动力学并再现二聚体的形成过程。(41, 42) 因此，我们进行了DEHP及其代谢物MEHP与α-Syn二聚体结合的分子动力学模拟（图6A）。首先对二聚体进行了200 ns的分子动力学模拟（图S3）。在动态过程中，RMSD在约10 ns后进入相对平衡范围，因此我们对达到稳定后的早期变化进行了视觉分析。发现经过2 ns模拟后，系统趋于平衡且结构稳定，这一稳定状态通过纵轴的均方根偏差（RMSD）值反映（图6B,C）。从约5 ns开始，DEHP二聚体复合物和MEHP二聚体复合物的结构逐渐趋向稳定构象（图6B,C）。图6 DEHP及其代谢物MEHP对α-Syn构象的影响。（A）α-Syn二聚体、DEHP-α-Syn二聚体和MEHP-α-Syn二聚体的模拟结构。（B）α-Syn二聚体、DEHP-α-Syn二聚体和MEHP-α-Syn二聚体的RMSD。（C）α-Syn二聚体、DEHP-α-Syn二聚体和MEHP-α-Syn二聚体的RMSF。（D和E）α-Syn二聚体、DEHP-α-Syn二聚体和MEHP-α-Syn二聚体的氢键。

为进一步了解α-Syn中各个残基对DEHP和MEHP结合的贡献，我们基于分子动力学模拟使用MM-PBSA方法进行了相对结合能的逐残基分解研究。稳定阶段的MM/PBSA结合自由能显示，DEHP参与后二聚体间的范德华效应（ΔEVDW）减弱，但静电作用力（ΔEele）显著增强（两个复合物中分别为?771.820和?750.941 kJ/mol）（图6A）。此外，ΔG结合值显示α-Syn与MEHP的结合更负（?465.918 kJ mol–1）（补充材料表S2）。值得注意的是，gmx_MPBSA的结合自由能指的是α-Syn二聚体中两条单链之间的能量。加入MEHP后，尽管ΔEMM变化不大，但极性溶剂化能显著降低（ΔGPB），导致总结合自由能增加（补充材料表S2）。由于DEHP和MEHP都增强了静电作用力，我们分析了二聚体形成过程中的氢键。与二聚体本身相比，加入DEHP后二聚体两条链之间的氢键增强（图6D,E）。为了更详细地观察二聚体之间的构象变化，RMSF分析显示加入MEHP后原子1000的波动显著降低，增强了结构的稳定性（图6C）。此外，自由能残基分析显示，与小分子二聚体相比，DEHP结合后Glu106残基的相互作用显著增强（图6E）。加入MEHP后，Gly51和Val66之间的相互作用显著增强。因此，这些结果支持了在模型条件下DEHP及其代谢物MEHP提高二聚体界面稳定性的可能性，从而促进复合物（α-Syn二聚体）的形成。氨基酸残基Glu106、Gly51和Val66可能是DEHP和MEHP促进α-Syn二聚化的最可能位点。

4. 讨论

全球范围内塑料的滥用日益加剧，最终导致环境中塑料碎片大量增加，这对生态系统健康和生物多样性有害。(43, 44) 一旦塑料分解为微塑料并释放其添加剂，管理将越来越困难。(45, 46) DEHP是聚氯乙烯等软塑料中最重要的、应用最广泛的增塑剂。(47) 当接触油脂、高温或长期储存时，DEHP容易（迁移）渗出到环境或食物中。(48) DEHP进入体内后迅速水解为几种初级代谢物，其中MEHP被认为是主要毒性物质。(47) 本研究发现，DEHP通过脱髓鞘和抑制自噬流导致α-Syn错误折叠。这些病理性的错误折叠蛋白从神经元传递至小胶质细胞，诱导小胶质细胞激活并极化为M1型促炎亚型，导致神经毒性。随着塑料的长期使用，各种添加剂被释放到环境中。(49) DEHP是塑料制造中使用的主要增塑剂；其难以察觉的分散性可分布到多个地点，被指定为"全球毒性债务"。(50) 全球DEHP的生产和消费量从1970年的180万吨增加到2009年的620万吨，2011年超过800万吨。(51) DEHP有可能通过径流、未经处理的家庭和工业废水以及垃圾填埋场的渗出液渗入地表水和地下水。随后，通过摄食、呼吸甚至皮肤接触，DEHP在水生生物中逐步积累，最终通过食物链传播。DEHP具有内分泌干扰和致畸效应，六种关键邻苯二甲酸酯——草二酯（DMP）、丁苯二甲酸酯（DBP）、二乙基邻苯二甲酸酯（DEP）、苯苄基邻苯二甲酸酯（BBP）、DEHP和二-n-辛基邻苯二甲酸酯（DnOP）——已被美国环境保护署（USEPA）列为优先污染物。此外，四种PAE（DIBP、DBP、BBP、DEHP）已被列入欧洲共同体受授权和限制的化学品清单。鸟类处于更高的营养级，能更敏感地反映污染物在生态系统中的累积效应。通过观察鸟类受到的损害（如神经、生殖和发育毒性），可以间接揭示人类通过食物链（如谷物和水产品）暴露于增塑剂的潜在风险。海鸟消化系统中DEHP的浓度（175 ± 97%）显著升高。在脱髓鞘研究方面，大多数研究集中在哺乳动物上，脱髓鞘是神经系统疾病的典型症状。(52) 我们的研究发现DEHP在鸟类中引起脱髓鞘。自噬过程分解细胞质成分、异常蛋白聚集体和功能失调的细胞器，这些成分可以被回收利用以维持细胞和机体稳态，并在细胞受胁迫时保护细胞存活。(53) 异常自噬过程导致蛋白错误折叠。(54) 已广泛观察到小胶质细胞负责清除大脑中的错误折叠和聚集蛋白。我们的研究也发现小胶质细胞中存在α-Syn且处于聚集状态。α-Syn肽的积累是神经系统的重要病理标志物。(18) 本研究发现DEHP抑制自噬流并促进α-Syn错误折叠。分子动力学模拟是研究这些分子尺度过程的重要工具。(55) 鉴于MEHP是体内DEHP的主要活性代谢物，为更准确地阐明DEHP与α-Syn之间的关系，我们分别设计了DEHP和MEHP与α-Syn的分子动力学模拟。本研究表明，加入DEHP和MEHP促进了二聚体的形成并增强了静电作用力。α-Syn的N端和非淀粉样β区域是常受影响的区域。(56) 通过同源比较和分子动力学模拟，我们发现人类和鹌鹑之间的N端同源性高度一致。

基于上述情况，有充分理由推测 α-Syn 在人类疾病中的作用模式也可能适用于家禽。小胶质细胞是中枢神经系统中的固有免疫细胞，已被观察到会对大脑稳态的变化作出反应。(57) 针对脑部损伤或感染，小胶质细胞会通过一种称为小胶质细胞增生的过程被迅速激活，以执行其他几项重要功能。(58) 本研究发现，错误折叠的蛋白质从神经元传递到小胶质细胞，使其被激活为促炎亚型。鸟类既是环境污染的受体，也是人类健康风险的哨兵。通过鸟类研究，DEHP 诱导的神经损伤的关键环节得以在更短周期和更可控制的方式下揭示，为相关人类疾病的预防和机制干预提供了重要证据。然而，本研究也存在一定的局限性。尽管我们通过细胞实验证实 DEHP 及其代谢物 MEHP 可诱导毒性蛋白质错误折叠并促进小胶质细胞向 M1 型极化，但这些结论目前仅限于 HMC3 细胞模型。未来研究需要从小鸡（鹌鹑）中提取原代神经细胞进行同步验证，以便在更接近鸟类生理环境的体系中确认上述机制。数据可用性 支持本研究结果的数据可在合理请求下从通讯作者处获得。