《Medical Microbiology and Immunology》：Interferon-γ-response to mycobacterial glycopeptidolipids in patients with pulmonary non-tuberculous mycobacterial infection
编辑推荐：
对人类非结核分枝杆菌（NTM）肺部感染宿主应答的认识尚不完整，免疫诊断工具亦未建立。与结核分枝杆菌复合群不同，多种NTM在其细胞壁表达糖肽脂质（GPLs）。本研究探讨了分枝杆菌GPLs诱导的干扰素-γ（IFN-γ）应答及其在肺NTM感染患者中的诊断价值。研究人
对人类非结核分枝杆菌（NTM）肺部感染宿主应答的认识尚不完整，免疫诊断工具亦未建立。与结核分枝杆菌复合群不同，多种NTM在其细胞壁表达糖肽脂质（GPLs）。本研究探讨了分枝杆菌GPLs诱导的干扰素-γ（IFN-γ）应答及其在肺NTM感染患者中的诊断价值。研究人员采用来源于鸟分枝杆菌（M. avium）的GPLs，体外刺激外周血单个核细胞（PBMC），对肺NTM感染患者及3个对照组（1）结核病（TB）患者、（2）无NTM感染证据的囊性纤维化（CF）患者、（3）健康对照（HC）进行ELISpot检测。比较各组间免疫应答，并对NTM患者中鸟分枝杆菌复合群（MAC）或脓肿分枝杆菌复合群（MABC）亚组进行分析。31例NTM患者（16例MABC、11例MAC、1例MABC合并MAC、3例其他NTM）的IFN-γ应答与43例对照（15例TB、15例CF、13例HC）进行比较。NTM组对GPLs的应答显著强于对照组（每300,000个PBMC中13.5个斑点对1.5个斑点，p<0.0001，数据为中位数）。MAC患者的总体反应强于MABC患者。检测敏感性和特异性分别为：MAC 64%和98%，MABC 19%和95%，全部NTM 32%和98%。分枝杆菌GPLs是IFN-γ应答的强效驱动因素。肺NTM感染患者对GPLs的免疫应答强于未感染参与者，使GPLs成为开发NTM免疫诊断工具的有前景靶点。
非结核分枝杆菌（NTM）相关肺部感染，包括鸟分枝杆菌复合群（MAC）和脓肿分枝杆菌复合群（MABC），在慢性肺疾病如囊性纤维化（CF）患者中构成严峻临床挑战。目前NTM肺病（NTM-PD）的诊断仍较困难，虽然干扰素-γ释放试验（IGRA）已革新结核病诊断，但在NTM疾病中尚未发挥重要作用。与结核分枝杆菌不同，许多NTM菌种表面表达糖肽脂质（GPLs）——一种被认为可调节宿主-病原体相互作用和免疫应答的暴露型糖脂。已有研究显示，检测抗GPL核心IgA抗体作为NTM肺病的血清学标志物具有中等效用；GPL诱导的IFN-γ释放在儿童人群中可区分NTM淋巴结炎与其他原因淋巴结炎、结核病及健康对照；然而，GPL驱动的IFN-γ应答在肺NTM感染中尚未被研究。因此，本研究旨在评估基于GPL的IGRA在区分肺NTM感染患者与未感染对照中的诊断潜力，假设GPL特异性T细胞应答能够区分肺NTM感染者与未感染者，从而可能为新型免疫诊断试验提供基础。
研究人员从德国埃森大学医院儿童与成人肺病科招募研究参与者。NTM组包括至少一次支气管肺泡灌洗液NTM阳性或两次独立痰标本同种NTM阳性的CF及非CF参与者；对照组包括无NTM感染微生物学证据的CF患者、经结核分枝杆菌IGRA证实的当前或既往结核病（TB）患者以及健康者。该研究共计纳入31例肺NTM感染患者（16例MABC、11例MAC、1例MABC合并MAC、3例其他NTM）和43例对照（15例TB、15例CF、13例HC）。主要技术方法为：采集外周血并采用Ficoll密度梯度离心分离PBMC；以鸟分枝杆菌来源的GPLs刺激每孔300,000个PBMC，经48小时预孵育后再进行20小时ELISpot检测，借助标准化系统（T-Track? ELISpot试剂盒）检测IFN-γ产生；同时使用商业T-SPOT.TB检测对结核分枝杆菌复合群（以及麻风分枝杆菌和某些环境分枝杆菌）的免疫反应。未刺激阴性对照的斑点数从GPL刺激培养结果中扣除，计为斑点增量；敏感性、特异性通过受试者工作特征（ROC）曲线分析确定，组间比较使用Mann-Whitney U检验。
**参与者入组与特征**
该研究共纳入31例肺NTM感染患者和43例对照。其中16例为MABC感染，11例为MAC感染，1例为MABC与MAC合并感染，3例为其他NTM（M. szulgai、M. gordonae、M. xenopi）。所有NTM阳性参与者均符合美国胸科学会（ATS）规定的NTM-PD微生物学标准，但其中16例未满足临床（包括影像学）标准。在12例可获取菌落形态信息的MABC患者中，6例为光滑（富GPL）菌落形态，1例为粗糙（低GPL）菌落形态，5例同时存在两种形态。TB组15例患者T-SPOT.TB均阳性，其中12例为活动性结核，1例为既往肺结核，2例为潜伏性结核。
**NTM特异性IGRA检测NTM感染的性能**
总体而言，NTM组对GPLs的体外细胞应答显著强于合并对照组（中位数13.5对1.5个斑点/每300,000个PBMC，p<0.0001）。MAC和MABC亚组均显著强于合并对照（MAC：26对1.5个斑点，p<0.0001；MABC：5.25对1.5个斑点，p=0.0012）。MAC患者反应显著强于MABC患者（26对5.25个斑点，p=0.0205）。以>23个斑点增量为阳性判定阈值（旨在确保高特异性的同时权衡敏感性与特异性），检测敏感性和特异性分别为：MAC 64%和98%，MABC 19%和95%，全部NTM 32%和98%。临床NTM-PD患者与仅微生物学符合NTM-PD患者之间的体外交答无显著差异（14.5对18.75个斑点，p=0.6328）。比较MABC患者中混合菌落形态（n=5，13.5个斑点）、粗糙菌落形态（n=1，2.5个斑点）与光滑菌落形态（n=6，5个斑点）之间的应答差异，未发现统计学显著性。除TB组外，所有研究参与者的T-SPOT.TB结果均为阴性。
**讨论**
该研究表明，鸟分枝杆菌来源的GPLs在肺NTM感染患者中诱导显著强于未感染个体的IFN-γ应答，支持GPLs是可测量的T细胞介导免疫应答的强效驱动因素，并可能是NTM感染的有前景诊断靶标。GPL-IGRA显示出高特异性（98%），但敏感性有限且依赖NTM菌种，MAC患者敏感性（64%）显著高于MABC患者（19%）。由于刺激所用GPLs来源于MAC，因此其对MAC患者表现出更好的检测性能并不意外。不同NTM菌种乃至同种内不同菌株或菌落形态间的GPL表达和组成存在差异，MABC菌株（尤其是毒力较强的粗糙型菌落）往往表达很少或不表达GPL，这可能削弱免疫识别。但本研究仅一例为纯粗糙型MABC分离株，其余为光滑型或混合型，故无法判断GPL表达水平与IFN-γ应答水平之间的关联。菌落形态并非NTM中GPL表达的普遍替代标志；此外，尽管存在保守的脂肽核心，不同菌种和血清型间通过糖基化等修饰产生结构多样性，因此保守核心可能作为更广谱的GPL-IGRA候选抗原，而菌种特异性结构则可构建定制抗原组以提高菌种鉴别能力。与已见中等敏感性和特异性的抗GPL-core IgA血清学检测相比，GPL-IGRA可直接评估细胞介导免疫。本研究中临床NTM-PD与无临床NTM-PD者间应答无显著差异；一例无NTM分离史的CF患者GPL-IGRA阳性，可能提示既往自行清除的感染或培养失败。更大队列和纵向研究将有助于评估该试验区分活动性感染与定植的潜力，也可能用于治疗反应监测。
**结论**
本研究确认了分枝杆菌GPL的免疫原性，并加强了其在肺NTM感染（尤其是MAC所致感染）中的诊断潜力。未来研究应同时利用GPL的保守特征和物种特异性特征，在大规模队列中评估共享GPL核心结构及物种特异性抗原组合。
