《Frontiers in Cardiovascular Medicine》：Cardio-oncology-relevant programmes in the cervical cancer tumour microenvironment: an exploratory multi-omics and endothelial-cell study
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摘要翻译：
背景：贝伐珠单抗（bevacizumab）和免疫检查点抑制剂（immune-checkpoint inhibitors，ICIs）可改善晚期宫颈癌患者的预后，但可能引发心血管毒性（cardiovascular toxicity，CVT）。公开的
摘要翻译：
背景：贝伐珠单抗（bevacizumab）和免疫检查点抑制剂（immune-checkpoint inhibitors，ICIs）可改善晚期宫颈癌患者的预后，但可能引发心血管毒性（cardiovascular toxicity，CVT）。公开的宫颈癌转录组数据集不包含心脏组织或经裁定（adjudicated）的CVT结局；因此，肿瘤微环境（tumour microenvironment，TME）中的表达本身无法确立心脏易感性机制。研究人员重新分析了现有数据，以提出一个更窄的问题：宫颈组织是否含有与心脏肿瘤学生物学相关的血管生成、内皮、炎症、T细胞耗竭及转化生长因子-β（TGF-β）/纤维化程序。
方法：分析了GSE208653中全部9个单细胞RNA测序样本：2个HPV阴性健康宫颈、2个HPV阳性组织学正常宫颈、2个高级别鳞状上皮内病变、2个鳞状细胞癌和1个腺癌。经过预设质量控制后，74,457个细胞通过Harmony整合并注释为宽泛谱系。预设的模块评分和四个配体–受体表达乘积评分按生物学样本汇总；恶性与非恶性差异采用精确的样本标签置换检验及Benjamini–Hochberg校正进行评估。对GSE208654的四个Visium计数矩阵在斑点水平进行了描述性分析。在304例TCGA-CESC原发肿瘤中评估了五个程序间的共表达。来自HUVEC（ATCC PCS-100-010）和原代人主动脉内皮细胞（HAEC；ATCC PCS-100-011）的qRT-PCR汇总数据被重新解释为内皮药理学证据，而非心脏验证。
结果：单细胞RNA测序图谱包含32个聚类，涵盖上皮、免疫、内皮和基质谱系。经多重检验校正后，五个样本水平程序在恶性和非恶性样本间均无显著差异（所有q ≥ 0.119）。同样，VEGFA–KDR、IL1B–IL1R1、TGFB1–TGFBR2或LGALS9–HAVCR2表达乘积评分均无显著差异（所有q ≥ 0.143）。四个空间样本显示斑点水平表达异质性，但由于每种组织学仅一个样本且提供的矩阵中无切片坐标，不支持组水平空间推断。TCGA肿瘤显示肿瘤内协调表达，以血管生成与TGF-β/纤维化之间的相关性最强（Spearman ρ=0.707；q = 2.24 × 10?46），但TCGA-CESC不包含CVT终点。VEGFA增加HUVEC中KDR、ICAM1、VCAM1和EDN1 mRNA，贝伐珠单抗减弱这些变化；IL-1β诱导HAEC中炎症转录本，阿那白滞素（anakinra）减弱IL6、TNF和CXCL8的表达。
结论：宫颈组织含有与心脏肿瘤学相关的转录程序，但现有数据既不能证明心脏表达，也不能确定贝伐珠单抗或ICI诱导的CVT易感性。内皮实验显示预期的通路反应性和药理学阻断，而非治疗诱导的心脏毒性。前瞻性分析必须使用匹配的临床结局比较CVT阳性和CVT阴性治疗患者，并理想地利用血液或心脏相关生物样本。
论文解读：
**研究背景、问题与目的**
宫颈癌是全球女性癌症发病和死亡的重要原因，尤其在筛查、人乳头瘤病毒（HPV）疫苗接种和多模式治疗可及性不均衡的地区负担更重。晚期、复发或转移性宫颈癌既往预后较差，系统治疗的发展成为临床优先方向。GOG 240研究确立了贝伐珠单抗联合铂类化疗可改善晚期宫颈癌总生存，但也记录了治疗相关血管不良事件。随后，免疫检查点抑制剂（ICIs）扩展了系统治疗选择，帕博利珠单抗、西米普利单抗以及阿替利珠单抗联合方案均改善了患者结局。随着有效方案应用时间延长并联合不同毒性特征的药物，心血管健康管理日益重要。贝伐珠单抗中和血管内皮生长因子A（VEGFA），其不良事件谱包括高血压、蛋白尿、动脉血栓事件、出血，偶见心力衰竭或心肌缺血。VEGF通过VEGFR2/KDR维持内皮一氧化氮生成、血管张力、微血管完整性和肾小球稳态，系统抑制VEGF可增加外周阻力并改变肾脏钠处理。然而，肿瘤内高VEGFA表达不等同于心脏组织中VEGF信号增强，亦不能在没有结局关联证据的情况下识别将发生贝伐珠单抗相关CVT的个体。ICI相关心血管不良事件在生物学和临床上不同，包括心肌炎、心包疾病、心律失常、传导障碍、心力衰竭、血管炎和潜在加速动脉粥样硬化事件。ICI心肌炎虽不常见但可暴发性发作，直接研究支持T细胞主导过程，但激发抗原、器官趋向性决定因素及为何仅少数暴露患者发病尚未完全明确。因此，比较治疗CVT阳性与CVT阴性患者对易感性研究至关重要。
宫颈肿瘤微环境（TME）是异质性的，在HPV相关恶性进展中发生变化。单细胞RNA测序和空间转录组学可解析宫颈组织区室中配体、受体和通路基因的表达，但对这些数据的过度解读可能将肿瘤内表达误认为心脏机制。原始来源分析每类疾病仅选一个样本，合并细胞，将简单配体–受体表达乘积标记为通讯概率，并利用仅含肿瘤的TCGA数据构建CVT风险框架。研究人员因此使用GSE208653所有样本和以生物学样本为推断单位进行完整再分析，预设五个广泛程序和四个透明的配体–受体表达乘积汇总，将GSE208654视为描述性斑点水平数据，并限制TCGA-CESC仅用于肿瘤内共表达分析。目标不是声称心脏机制或发现临床CVT生物标志物，而是确定宫颈组织中可检测到哪些心脏肿瘤学相关程序，量化其样本水平不确定性，并明确因果或预测推断所需的额外证据。
**研究设计与关键技术方法**
这是一项对公共宫颈组织转录组的二次分析，加上对先前生成的内皮细胞qRT-PCR汇总数据的重新解释。分析的所有公共队列均不包含抗癌治疗暴露、心脏生物样本、经裁定的CVT或CVT阳性/CVT阴性分组。主要推断比较是恶性宫颈样本（两个鳞状细胞癌和一个腺癌）与六个非恶性样本（健康、HPV阳性正常和HSIL）。样本来源包括GEO系列GSE208653全部9个单细胞样本（细胞数在质控后共74,457个）及GSE208654四个10x Visium空间计数矩阵（正常、HSIL、SCC、ADC各一），以及UCSC Xena GDC枢纽中304例TCGA-CESC原发肿瘤STAR-TPM谱。单细胞数据使用Scanpy导入，质控标准为每细胞200–5,999个基因及线粒体读取<20%，标准化后选择3,000个高变基因，使用Harmony 2.0.0整合，Leiden聚类分辨率为0.7。聚类注释为11个宽泛谱系。五个预设程序（血管生成、内皮激活、炎症、T细胞耗竭、TGF-β/纤维化）的得分按细胞计算后取生物学样本均值，其中内皮激活仅在内皮细胞中汇总、炎症在髓系细胞中、T细胞耗竭在T细胞中、TGF-β/纤维化在成纤维细胞/CAF中，血管生成跨所有细胞汇总。恶性与非恶性差异使用精确双尾置换检验（将九个样本中的三个分配为恶性组）并经Benjamini–Hochberg校正。四个配体–受体表达乘积（VEGFA–KDR、IL1B–IL1R1、TGFB1–TGFBR2、LGALS9–HAVCR2）在预设的发送/接收谱系中按样本计算均值乘积，同样进行置换检验。空间矩阵仅做描述性斑点水平分析。TCGA-CESC中计算五个程序得分的两两Spearman相关并经校正。内皮细胞实验使用HUVEC和HAEC（原代人主动脉内皮细胞，非AC16心肌细胞），分别用VEGFA±贝伐珠单抗和IL-1β±阿那白滞素处理24小时，检测qRT-PCR mRNA汇总数据（仅提供均值±SEM，无原始Ct值）。
**研究结果**
1. **全样本宫颈单细胞图谱**：全部9个GSE208653样本纳入，74,457个细胞通过质控，Harmony整合聚类得到32个聚类并注释为11个宽泛谱系。同一疾病条件下的不同样本间细胞类型比例差异显著，这种样本间变异促使采用样本水平而非细胞水平推断。
2. **样本水平上无预设程序显著**：五个程序的均值得分在三个恶性样本中数值上均高于六个非恶性样本，但校正后均未达到预设的假发现率阈值。最小名义P值为T细胞耗竭（P=0.0238），校正后q=0.119。因此数据不支持这些程序在恶性宫颈组织中显著上调的说法。
3. **宫颈TME配体–受体表达乘积不显著**：四个表达乘积在部分样本中可检测到，确认相应配体和受体转录本在指定宫颈TME谱系中共表达，但恶性与非恶性样本间均无显著差异。VEGFA–KDR效应0.029（q=0.905），IL1B–IL1R1效应0.129（q=0.905），TGFB1–TGFBR2效应?0.049（q=0.619），LGALS9–HAVCR2效应0.081（q=0.143）。这些结果仅限于宫颈组织，不能外推至心脏。
4. **空间计数矩阵仅提供描述性斑点水平支持**：质控后保留4,852个斑点，转录组UMAP显示样本内及样本间异质性，VEGFA、IL1B和TGFB1在部分斑点表达。由于每种组织学仅一个样本且无物理切片坐标，不能建立空间共定位或支持恶性/正常统计声称。
5. **TCGA-CESC显示肿瘤共表达而非CVT预测**：在304例TCGA-CESC原发肿瘤中，10对程序相关性中有9对呈正名义相关，8对在校正后仍然显著。最强关联为血管生成与TGF-β/纤维化（Spearman ρ=0.707；q=2.24×10
?46），其后为内皮激活与TGF-β/纤维化（ρ=0.563；q=4.19×10
?26）。这些相关性仅显示肿瘤转录组内的协调性，未对任何患者进行CVT风险分类。
6. **内皮实验显示通路反应性和阻断**：在HUVEC中，VEGFA增加KDR、ICAM1、VCAM1和EDN1 mRNA相对表达，贝伐珠单抗减弱这些增加。在HAEC中，IL-1β增加IL1R1、NFKB1、IL6、TNF和CXCL8，阿那白滞素减弱IL6、TNF和CXCL8。这些结果与外源VEGFA的中和及IL-1受体依赖性炎症信号传导一致，但不代表心脏毒性或心肌细胞损伤。
**讨论与结论总结**
修正后的分析改变了研究核心解释。宫颈组织表达血管生成、内皮、炎症、耗竭和TGF-β/纤维化程序，TCGA肿瘤显示其中几个程序的大量共表达。然而，以生物学样本为分析单位时，没有预设计划或配体–受体表达乘积在恶性样本中经多重校正后显著。更重要的是，没有任何公共队列包含治疗暴露或CVT结局，因此数据无法识别CVT易感性机制。样本水平上缺乏校正显著性是信息性的：九个样本提供的分辨率有限，难以区分疾病分期效应与个体间变异。将数万细胞作为独立重复会产生极小的P值，但会高估患者水平证据。修正分析保留样本作为重复单位，以有效的不确定性取代表面精度。这些结果应视为规划更大研究的效应估计，而非证明这些程序不存在或不重要。该边界解决了“区室问题”——宫颈CAF产生VEGFA而宫颈内皮细胞表达KDR属于肿瘤基质观察，不能映射到心肌。肿瘤内IL1B–IL1R1或LGALS9–HAVCR2表达也不能确立区分ICI心肌炎病例的免疫细胞状态。贝伐珠单抗实验显示外源VEGFA增加内皮转录本而贝伐珠单抗降低它们，这是预期的药理学中和结果，并非毒性悖论。临床高血压通常与系统内皮和肾VEGF信号缺失相关，而24小时HUVEC测定不能模拟基础VEGF撤除、血压、血管阻力或慢性暴露。HAEC实验显示IL-1受体通路在主动脉内皮中具有药理学反应性，但未使用心肌细胞或ICI暴露，不能验证心脏损伤。TCGA分析显示肿瘤生物学中程序共存，但将TCGA肿瘤标记为“高CVT风险”会创造数据中不存在的结果。肿瘤特征在结局注释的研究中可作为候选修饰因素，但需与宿主变量（年龄、高血压、糖尿病、肾功能、心血管病史、放疗、化疗、剂量）一起评估，并需要内部验证、校准和独立队列。明确随访研究应入组贝伐珠单抗和/或ICI治疗前患者，使用当代心脏肿瘤学标准预设CVT定义，比较治疗CVT阳性与CVT阴性患者，纵向收集心血管协变量、血压、肌钙蛋白、利钠肽、心电图和影像，分子采样优先血液和心脏相关材料，以患者（而非细胞）为统计单位。该研究局限性包括GSE208653仅九个样本、条件与样本部分混淆、宽泛注释可能错分细细胞状态、配体–受体表达乘积为描述性、空间矩阵缺乏坐标、TCGA无治疗相关CVT、内皮测定仅检测选定mRNA且缺乏重复水平Ct值等。结论是：宫颈TME含有与心脏肿瘤学相关的转录程序，但在此小样本全样本再分析中，经多重校正后无预设单细胞程序或配体–受体表达乘积在恶性宫颈样本中显著。TCGA-CESC证实肿瘤内共表达但无CVT终点。HUVEC和HAEC实验显示通路反应性和受体导向阻断，而非心脏毒性。CVT易感性只能在具有结局注释的治疗患者中检验，理想地比较CVT阳性和CVT阴性组并使用心脏相关或循环生物样本。
