《Molecular Biomedicine》：The DCBLD2 super-enhancer drives colorectal cancer progression through FOSL2/JUND-mediated activation of the CD146/AKT/TNFRSF6B pathway
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超级增强子（super-enhancer, SE）是维持细胞身份基因表达的一系列顺式调控元件簇。其异常激活或功能失调构成恶性细胞转化的标志性事件，常通过重塑致癌转录程序以支持不受控制的细胞增殖和转移潜能。然而，结直肠癌（colorectal cancer,
超级增强子（super-enhancer, SE）是维持细胞身份基因表达的一系列顺式调控元件簇。其异常激活或功能失调构成恶性细胞转化的标志性事件，常通过重塑致癌转录程序以支持不受控制的细胞增殖和转移潜能。然而，结直肠癌（colorectal cancer, CRC）特异性超级增强子的功能及其表观遗传调控机制仍知之甚少，且鲜有研究聚焦于解析肿瘤富集型超级增强子如何介导CRC下游致癌信号。通过整合多组学测序数据，研究人员在结直肠癌中鉴定了一个高活性超级增强子，命名为DCBLD2-SE。通过荧光素酶报告基因实验，SE3-2亚区域被确认为该超级增强子的最小功能核心。机制研究表明，激活蛋白-1（activator protein-1, AP-1）家族转录因子FOSL2和JUND可直接结合SE3-2顺式调控元件，协同调控局部染色质重塑并强烈驱动靶基因DCBLD2的上调表达。敲除DCBLD2-SE核心区域后，结直肠癌细胞的恶性增殖能力显著下降，体内异种移植瘤的生长也受到明显抑制。在功能层面，DCBLD2-SE通过依赖于DCBLD2的CD146/AKT/TNFRSF6B信号轴促进肿瘤进展。在临床上，DCBLD2高表达与结直肠癌患者的恶性转移及不良总生存期相关。综上所述，本研究揭示了一条此前未被描述的以DCBLD2为核心的调控级联反应，该级联促进结直肠癌的发生与进展。DCBLD2-SE及其结合的转录因子激活蛋白-1代表了结直肠癌有前景的预后生物标志物和可行的治疗靶点。
**论文解读**
**一、研究背景与科学问题**
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球范围内最常见的消化系统恶性肿瘤之一。近年来，其发病率和死亡率持续上升，目前已成为全球第三大常见癌症。当前的临床治疗手段主要包括手术切除、化疗和靶向药物治疗，然而相当比例的患者在确诊时已处于局部晚期或转移阶段，失去了根治性手术的机会。因此，深入解析驱动CRC进展的表观遗传调控机制，并鉴定可操作的诊断生物标志物和治疗靶点，是当前亟待满足的临床需求。
超级增强子（super-enhancer, SE）是富含H3K27ac和H3K4me1等组蛋白修饰标记以及高密度转录因子（transcription factor, TF）结合的大型顺式调控元件簇。与传统增强子相比，SE具有显著更强的转录激活潜能。肿瘤发生通常伴随SE景观的表观遗传重塑，异常激活的SE可驱动癌基因过表达以维持恶性细胞表型。尽管全癌种表观基因组研究已在多种实体瘤中鉴定出肿瘤特异性SE特征，且靶向SE的干预策略已成为肿瘤学中有前景的治疗途径，但现有研究大多集中于泛癌SE谱分析和上游转录调控，对于CRC相关SE顺式元件与其下游跨膜致癌受体之间的调控关系缺乏深入剖析。
DCBLD2是由人类3号染色体q12.1位点编码的保守跨膜受体，其蛋白包含CUB、LCCL及凝血因子V/VIII同源结构域。DCBLD2通过血小板衍生生长因子和血管内皮生长因子信号调节血管生成，并参与肿瘤细胞增殖和侵袭。多组学分析已证实DCBLD2在CRC组织中显著过表达，且是CRC的独立预后风险因素。然而，其在CRC中病理性过表达的表观遗传机制尚未得到系统阐明。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员整合多组学测序数据，在结直肠癌细胞系中鉴定了一个此前未被表征的高活性超级增强子DCBLD2-SE。通过荧光素酶报告基因实验，SE3-2亚区域被确定为该超级增强子的最小功能核心元件。机制研究证实，激活蛋白-1（activator protein-1, AP-1）家族转录因子FOSL2和JUND可直接结合SE3-2顺式调控元件，协同调控局部染色质重塑，强烈驱动靶基因DCBLD2的上调表达。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除DCBLD2-SE核心区域后，结直肠癌细胞的恶性增殖能力显著下降，体内异种移植瘤生长受到明显抑制。功能研究表明，DCBLD2-SE通过依赖于DCBLD2的CD146/AKT/TNFRSF6B信号轴促进肿瘤进展。临床数据分析显示，DCBLD2高表达与结直肠癌患者的恶性转移和不良总生存期显著相关。该研究揭示了以DCBLD2为核心的调控级联反应促进CRC发生与进展的新机制，DCBLD2-SE及其结合转录因子AP-1可作为CRC的预后生物标志物和潜在治疗靶点。
**三、主要技术方法**
本研究采用了多项关键技术方法。在组学层面，研究人员整合了SE数据库（SEA）、Hi-C染色质构象捕获、H3K27ac ChIP-seq、ATAC-seq、RNA-seq及单细胞RNA-seq等多组学数据，用于SE鉴定和染色质结构分析。在功能验证层面，运用了CRISPR/Cas9基因编辑技术构建SE3-2和热点基序敲除细胞系、双荧光素酶报告基因实验、染色质免疫沉淀（ChIP-qPCR）、DNA pull-down、免疫印迹（Western blot）、免疫荧光染色、CCK-8增殖实验、划痕愈合实验、Transwell迁移与侵袭实验、集落形成实验及裸鼠皮下异种移植瘤模型。样本来源方面，细胞实验使用了HCT116、SW480、LoVo结直肠癌细胞系及NCM460正常结肠上皮细胞；体内实验使用了6周龄雌性BALB/c裸鼠。
**四、研究结果**
**（一）CRC细胞系中筛选并鉴定高活性SE**
研究人员通过挖掘SEA数据库，在HCT116细胞中鉴定出227个顺式调控元件，并与公共Hi-C数据交叉分析，基于染色质互作谱鉴定出20个具有H3K27ac修饰和增强子-启动子接触的候选SE位点。在SE活性排名前10的靶基因中，仅DCBLD2在CRC中高表达。H3K27ac ChIP-seq信号分析显示，该SE位点在6种CRC细胞系中均有显著富集，而在正常组织和非CRC肿瘤细胞系中信号较弱。单细胞RNA-seq数据分析显示，DCBLD2转录本在恶性上皮肿瘤细胞簇中显著富集。UALCAN和GEPIA2数据库分析证实，DCBLD2在CRC肿瘤组织中表达显著升高，且与淋巴结转移分期及患者总生存期和无病生存期显著相关。
**（二）SE3-2是DCBLD2-SE的主要活性组分**
Hi-C分析显示DCBLD2启动子与DCBLD2-SE位于同一拓扑关联结构域（topologically associating domain, TAD）内，相距57 kb。JQ1（BET溴结构域抑制剂）处理显著降低HCT116和SW480细胞中DCBLD2的mRNA和蛋白水平，表明DCBLD2-SE的转录调控是BRD4依赖性的。根据表观修饰特征，DCBLD2-SE被划分为SE1至SE4四个亚增强子单元。双荧光素酶报告实验显示SE3片段在CRC细胞中荧光素酶活性增加40倍，进一步细分后SE3-2亚区域活性增加38倍（HCT116）和25倍（SW480），被确认为最小功能核心单元。
**（三）FOSL2和JUND是调控SE3-2增强子活性的核心转录因子**
JASPAR基序预测分析在SE3-2中鉴定出4个转录因子结合热点基序。删除热点基序2导致报告基因活性降低约90%。AP-1抑制剂SR11302处理后，DCBLD2 mRNA表达降低65%，SE3-2增强子活性降低62%。siRNA筛选显示，敲低FOSL2或JUND分别使DCBLD2 mRNA表达降低40%和50%，SE3-2增强子活性分别降低80%和63%。DNA pull-down和ChIP-qPCR实验证实FOSL2和JUND可直接结合SE3-2区域。
**（四）CRISPR介导的DCBLD2-SE敲除揭示其在CRC细胞中的调控功能**
在HCT116、SW480和LoVo细胞中敲除SE3-2或热点基序2后，DCBLD2的mRNA表达水平降低约90%，蛋白水平同步受抑。Hi-C结果显示，SE缺失细胞中增强子区域与DCBLD2启动子区域的染色质互作频率降低。ATAC-seq分析显示SE1和SE2的染色质活性显著下降。ChIP-qPCR检测显示，SE1、SE2、SE4区域的H3K27ac富集分别降低75%、70%和67%，DCBLD2启动子区域的H3K27ac修饰降低77%。AP-1抑制可显著降低SE3-2位点和DCBLD2启动子的H3K27ac信号强度。
**（五）DCBLD2-SE通过CD146/AKT/TNFRSF6B信号轴驱动CRC进展**
RNA-seq分析鉴定出864个差异表达基因，其中上调460个、下调404个。KEGG通路富集分析显示细胞因子-细胞因子受体互作和PI3K-AKT信号通路显著变化。在DCBLD2-SE敲除细胞中，PI3K和TNFRSF6B的mRNA水平降低约60%，CD146 mRNA水平显著下降，VEGF水平降低约80%。外源性DCBLD2过表达可完全恢复这些下游信号介质的表达。机制上，DCBLD2-SE缺失破坏了DCBLD2-CD146互作，削弱PI3K-AKT活性并降低TNFRSF6B丰度。
**（六）DCBLD2-SE通过维持DCBLD2表达驱动恶性表型和体内肿瘤生长**
DCBLD2-SE缺失或SR11302处理显著抑制HCT116、SW480和LoVo细胞的增殖、迁移和侵袭能力，划痕愈合实验和Transwell实验证实了上述现象。集落形成实验显示DCBLD2-SE缺陷细胞的集落形成效率显著降低，而DCBLD2过表达可恢复其克隆形成能力。裸鼠皮下异种移植实验显示，SE敲除组肿瘤体积和重量减少超过70%，SR11302处理同样显著抑制肿瘤生长。免疫组化染色证实DCBLD2-SE敲除或SR11302处理降低了DCBLD2和增殖标志物KI67的免疫反应性，CD34染色证实肿瘤内血管生成减少，且未观察到明显的脏器毒性。
**五、讨论与结论**
本研究鉴定了一条此前未知的CRC表观遗传调控轴。机制上，DCBLD2-SE通过招募FOSL2/JUND复合物激活DCBLD2-CD146/AKT/TNFRSF6B信号级联，从而驱动CRC恶性进展。在DCBLD2-SE区域密集聚集的AP-1转录因子可能有效隔离细胞内AP-1库，这种反式作用效应可能扩展至同一TAD内或不同染色质结构域中的其他增强子。SE内SE1/SE2/SE3/SE4亚模块的协同活性建立了协同染色质状态，使DCBLD2转录水平超过单个增强子单独作用所能达到的程度。研究存在以下局限性：多肿瘤队列公共H3K27ac ChIP-seq数据分析仍属初步，需扩展泛癌表观基因组数据集；功能实验主要在HCT116、SW480和LoVo细胞中进行，无法完全确定DCBLD2-SE在所有共识分子亚型（consensus molecular subtype, CMS）肿瘤亚组中均一致驱动致癌信号；Hi-C和RNA-seq虽证实DCBLD2是DCBLD2-SE的主要顺式靶标，但不能完全排除间接反式调控效应；siRNA筛选虽确定FOSL2和JUND为主要驱动因子，但AP-1二聚体与增强子的结合具有简并性和环境依赖性；体内实验采用组成型CRISPR介导的SE敲除，SE缺失细胞预先存在的增殖缺陷可能部分影响初始肿瘤植入。
**研究结论翻译**：综上所述，本研究在结直肠癌中鉴定了一条此前未被表征的表观遗传调控轴。机制上，DCBLD2-SE招募FOSL2/JUND复合物以激活DCBLD2-CD146/AKT/TNFRSF6B信号级联，从而驱动CRC恶性进展。这些发现确立了DCBLD2-SE及其上游调控因子作为有前景的预后生物标志物和治疗靶点，为CRC的表观遗传精准治疗提供了新的机制支持。
