《International Journal of Medical Microbiology》：Whole-genome sequencing of SARS-CoV-2 virus in clinical isolates at a tertiary care centre: A retrospective cross-sectional study
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专业术语翻译摘要：
背景：通过快速、实时基因组测序对SARS-CoV-2变异株（包括快速传播的突变株）进行监测，已被广泛报道为COVID-19大流行期间 informed 卫生政策决策的重要工具。本研究旨在对SARS-CoV-2 RT-PCR阳性样本进行全
专业术语翻译摘要：
背景：通过快速、实时基因组测序对SARS-CoV-2变异株（包括快速传播的突变株）进行监测，已被广泛报道为COVID-19大流行期间 informed 卫生政策决策的重要工具。本研究旨在对SARS-CoV-2 RT-PCR阳性样本进行全基因组测序，以识别印度中部流行的SARS-CoV-2变异株，重点关注新的关注变异（variants of interest, VOI）和关切变异（variants of concern, VOC）。
方法：研究人员建立了用于SARS-CoV-2遗传监测的纳米孔测序平台，并聚焦于识别印度中部流行的变异株。这项回顾性横断面研究对2022年5月至2023年12月期间经实验室RT-PCR确诊的COVID-19患者的样本进行了基因组测序和数据分析。研究纳入CT值≤25的样本，以实现测序后>70%的基因组覆盖率。
结果：分析识别出奥密克戎（Omicron）变异株及其亚谱系在流行，并将其归入五个进化枝：23B、22D、21L、22F和24A。进化枝23B最为普遍，占样本的42.8%，其次是进化枝22D和21L，合计占样本的52.3%。进化枝23B中的主要变异株为XBB.1，而进化枝22D中则以BA.2.75.1为主。
结论：这些发现阐明了SARS-CoV-2的进化模式，进而为COVID-19预防与控制政策决策提供支持。本研究强调，早期检测关切变异（VOC）和关注变异（VOI）对于应对疫情激增至关重要。
论文解读：
研究背景与问题：
自COVID-19大流行以来，SARS-CoV-2作为一种正义单链RNA病毒，其基因组约30 kb，具有较高的遗传变异性和较快的进化速率。基因组监测对于早期检测突变、监测病毒进化以及评估流行变异株至关重要。世界卫生组织（WHO）根据遗传特征、流行病学影响、传播力、疾病严重程度以及对诊断、治疗和疫苗的潜在影响，将SARS-CoV-2变异株分类为关注变异（VOI）和关切变异（VOC）。印度在疫情中经历了显著变异株更替：早期以B.1为主，中期Delta（B.1.617.2）引发第二波疫情，并在2021年5月被WHO列为VOC；2022年中起，Omicron及其亚谱系成为全球优势变异株。印度SARS-CoV-2基因组学联盟（INSACOG）持续监测到BA.2、BA.4、BA.5及BA.2.75等亚谱系的出现与共循环。然而，印度中部地区（特别是维达尔巴地区）的基因组监测数据仍相对不足，该区域在全球基因组研究中代表性较低。因此，有必要通过全基因组测序在该地区开展持续监测，以识别流行的变异株及其突变特征，为疫情防控提供区域性的科学依据。
研究开展与结论：
研究人员在印度那格浦尔全印度医学科学研究所（AIIMS Nagpur）微生物学系建立了基于牛津纳米孔技术（ONT）的测序平台，开展了一项回顾性横断面研究。研究对象为2022年5月至2023年12月期间经RT-PCR确诊的COVID-19患者，共纳入63份CT值≤25的阳性样本。测序后平均基因组覆盖率为85.96%，平均每样本产生0.32百万条读数，中位读长519.48 bp。所有样本均属于Omicron变异株，共鉴定出五个进化枝：23B、22D、21L、22F和24A。其中进化枝23B最为普遍（42.8%，n=27），其次为22D（n=25）和21L（n=8），后两者合计占52.3%。进化枝23B的主要变异株为XBB.1，进化枝22D的主要变异株为BA.2.75.1。在Pangolin谱系分类中，BA.2.75.1频率最高（n=10），其次为BA.2.75（n=8）和XBB.1（n=7）。研究还发现，BA.2变异株的刺突蛋白存在D405F和S371F两个常见突变；22D进化枝中的BL.1变异株具有S: I368L、P445V、S490F、D574V等刺突蛋白突变及ORF3a区A54V突变；JN.1.1变异株存在刺突蛋白F499L和ORF1b区S662G突变。此外，在22D进化枝内，BA.2.75.1与BM.1.13之间存在明显突变模式差异：S: D574V突变在BM.1.13中缺失，而存在于该进化枝其他所有变异株中。这些发现明确了SARS-CoV-2在印度中部的进化模式，支持了早期检测VOC和VOI以应对疫情激增的政策决策，并为区域疫苗株选择、临床准备和发现更具免疫逃逸能力的谱系提供了数据支持。
主要关键技术与方法：
研究人员使用MagRNA-II病毒RNA提取试剂盒从鼻咽和口咽拭子样本中提取病毒RNA，并通过实时RT-PCR检测阳性样本（CT值≤25）。全基因组测序采用ONT Midnight扩增子测序方案，使用LunaScript RT Supermix进行cDNA合成，经PCR扩增后，利用快速条形码试剂盒（SQK-RBK 110.96）和连接试剂盒（SQK-LSK110）构建文库，在MinION Mk1B平台的SpotON Flow Cell（R9.4.1）或Flongle Flow Cell上测序。生物信息学分析使用ARTIC流程，将读段比对至SARS-CoV-2参考基因组（Wuhan株，MN908947.3），通过SAMtools生成共有序列，Nano polish进行变异 calling，SNPeff进行注释，Nextclade（2.3.0版）和Pangolin（4.1.1版）分别进行进化枝和谱系分配。样本队列来自印度中部那格浦尔及周边地区（包括阿科拉、班达拉和塞奥尼）的实验室确诊COVID-19患者。
研究结果：
人口统计学与临床特征：共分析63例病例，其中男性28例（44.44%），女性35例（55.6%）。总体平均年龄40.04岁，男性平均46.02岁，女性平均35.2岁。最高发年龄组为21-30岁（n=18），其次为31-40岁（n=12）。21-30岁年龄组中进化枝22D为主（n=10），进化枝23D分布于多数年龄组，进化枝22F和24A各仅1例。63例中38例（60%）无症状，25例（40%）有症状。
测序与进化枝分布：63份样本经扩增子测序，平均基因组覆盖率85.96%，最小测序深度10X。共有序列鉴定出五个进化枝，23B最普遍（42.8%），22D和21L合计占52.3%。所有变异株均属于Omicron。谱系分类显示BA.2.75.1最频繁，其次为BA.2.75和XBB.1。
突变谱分析：在BA.2变异株刺突蛋白中鉴定出D405F和S371F突变；BL.1变异株具有多个刺突蛋白突变和ORF3a突变；JN.1.1变异株具有刺突蛋白F499L和ORF1b S662G突变；BA.2.75.1与BM.1.13间存在S: D574V突变有无的关键差异。
系统发育与地理分布：系统发育树展示了不同进化枝间的进化关系。进化枝23B主要在那格浦尔检测到，其次为阿科拉，班达拉和塞奥尼未检出；进化枝22D主要分布在那格浦尔和班达拉，阿科拉和塞奥尼也有零星检出，其他进化枝少见。
讨论与结论：
讨论部分强调，自大流行以来变异株毒力和传染性逐波增强，持续基因组监测对于追踪新变异和突变至关重要。全球范围内Omicron亚谱系呈现序贯优势更替（BA.1/BA.2、BA.4/5、XBB后代），本研究中XBB/BA.2.75亚谱系的优势与全球及印度其他地区数据一致。XBB由BA.2谱系重组产生，具有高度免疫逃逸能力。实时区域性纳米孔WGS能够稳健追踪VOI/VOC的出现，填补了维达尔巴地区的地理监测空白，为区域疫苗株选择和临床准备提供了依据。研究结果与INSACOG和GISAID报告基本吻合：2022年下半年BA.2亚谱系（如BA.2.74、BA.2.75、BA.2.76）流行，2023年上半年XBB重组谱系占优势（XBB.1.16在2023年4月占79.17%），2023年下半年至2024年初JN.1上升至93.83%。研究优势在于提供了维达尔巴地区重要的区域性数据、展示了ON平台在三级护理实验室中的成本效益测序能力、提供了进化枝和变异株分类以及突变水平见解；局限性包括样本量受经费限制、仅测序高病毒载量（Ct≤25）样本可能遗漏低病毒载量病例中的变异、临床结局相关性不在研究范围内。
结论翻译：基因组监测在整个COVID-19大流行中对于理解病毒传播和进化至关重要。本研究强调了在印度马哈拉施特拉邦第二波疫情期间对循环SARS-CoV-2变异株进行持续基因组监测的重要性。
