高空间分辨率转录组揭示杨树应拉木收缩性G层形成的遗传程序

《Frontiers in Plant Science》：A high spatial resolution transcriptomics of tension wood reveals the genetic program of contractile G-layer formation

　　

摘要：应拉木（TW）的形成涉及G纤维的分化，这些纤维沉积富含纤维素、具收缩性的胶质层（G层）。尽管已有广泛研究，但G层形成背后的生物合成程序仍未完全解析，部分原因在于发育阶段的取样不够精确。本研究通过对杨树（Populus tremula）应拉木和正常木（NW）形成组织进行切向冷冻切片，生成了高空间分辨率的转录组图谱。研究人员将显微镜测定的细胞壁增厚谱与全转录组数据叠加，从而区分出七个可辨别的TW阶段和三个NW阶段，并在TW形成过程中清晰分离出早期和晚期G层特异的转录程序。在22,363个表达基因中，90个共表达簇捕捉到了定义细胞壁生物合成、信号传导、细胞骨架动力学和胁迫响应的主要程序。差异表达分析鉴定出2,898个在早期或晚期G层形成期间特异调控的基因——这表明TW中存在大规模的转录重组。参与纤维素、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I（RG-I）、阿拉伯半乳聚糖II（AG-II）和胼胝质代谢的基因显示出独特的诱导模式，包括此前未被发现参与G层形成的碳水化合物活性酶（CAZymes）。研究人员还鉴定了G层特异性基因，包括 XTH26 (PtXTH5)、SCL18、AGL29，以及编码FLA12样阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）和LIM蛋白的基因。三十个不同于次生壁诱导型 NACs 和 MYBs 的转录因子，以及多个在G层形成起始阶段特异诱导的激素调控相关基因，代表了三级G层分化的新型潜在调控因子。综上，这一空间解析的转录组提供了迄今为止最详细的TW形成分子程序图谱，为理解木本植物中G层生物合成、信号网络和细胞壁特化提供了新见解。

研究背景与科学问题

木材是陆地生态系统中最丰富的生物质资源之一，而应拉木（Tension Wood, TW）是一种在被子植物中普遍存在的特殊木材类型。当树木受到重力刺激（如倾斜茎干）时，会在茎干上侧形成TW，其核心特征是在木质部纤维细胞中分化出一种特殊的收缩性细胞壁层——胶质层（Gelatinous layer, G层）。G层具有极高的结晶纤维素含量、极低的微纤丝角（小于10°）、几乎不含木质素，并且含有特殊的基质多糖组成（如鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I、阿拉伯半乳聚糖II等）。这种结构赋予G层卓越的抗拉强度和湿度敏感性，使其成为仿生材料（如纳米纤维素纤维和纤维素基张力致动器）的理想模型。然而，尽管G层的力学特性已被广泛关注，其生物合成的分子机制——尤其是从次生壁S层切换到G层时的转录重编程、多糖合成酶的动态变化以及关键调控因子的身份——仍远未阐明。此前的组学研究多采用整体组织对比（如TW对NW）或时间序列分析，但受限于取样精度，难以捕获G层发育过程中连续且精细的基因表达变化。单细胞转录组技术虽能提供细胞类型分辨率，却因成熟细胞的原生质体分离困难而无法覆盖G层形成的后期阶段。因此，亟需一种能够在完整发育梯度上获得高分辨率转录组信息的方法，以系统解析G层形成的遗传程序。

研究内容与主要结论

为填补上述空白，研究人员以欧洲山杨（Populus tremula）为材料，通过将植株倾斜3周诱导TW形成，并对TW和正常木（Normal Wood, NW）形成区域进行连续的切向冷冻切片，结合显微测定的细胞壁厚度曲线，建立了涵盖TW七个发育阶段（T1–T7）和NW三个阶段（N1–N3）的高空间分辨率转录组图谱。主要结论包括：（1）TW形成涉及大规模的转录重组，共鉴定出2,898个在G层早期或晚期特异调控的差异表达基因（DRGs），而NW中仅发现58个DRGs；（2）90个共表达簇定义了细胞壁生物合成、信号传导、细胞骨架动力学和胁迫响应等主要生物学程序；（3）发现了G层特异的多糖合成酶基因，包括参与纤维素合成的 PtCesA8-B、PtCOBL4b、PtCSLD8，参与RG-I合成的 PtRRT1-A/B、PtRGGAT1-A/B，以及参与阿拉伯半乳聚糖II（AG-II）合成的多个GT家族成员；（4）鉴定出一个G层特异的FLA12亚支（C11A3.1–3.3），其中多数成员在G层形成期间显著上调；（5）发现染色体14上的一个胼胝质代谢基因簇在G层形成中特异诱导；（6）鉴定出30个非经典的转录因子（非NAC/MYB家族）和多个激素调控基因在G层起始阶段特异诱导，这些因子被认为是G层分化的新型潜在调控因子。

主要关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：（1）切向冷冻切片法：对诱导TW和对照NW的杨树茎干形成区进行连续30 μm厚的切向冷冻切片，结合扫描电镜（SEM）测定的细胞壁厚度曲线，将切片按发育阶段精准合并；（2）RNA测序与转录组分析：对合并后的样品进行链特异性RNA-seq，共检测到22,363个表达基因，并通过主成分分析（PCA）和标记基因表达谱确定发育阶段；（3）差异表达分析与共表达聚类：以高阈值（pAdj ≤ 0.01, |log2FC| ≥ 1）鉴定G层形成早期（T3 vs T1/T2）和晚期（T4–T7 vs T1/T2）的DRGs，并进行分层聚类获得90个共表达模块；（4）CAZyme注释与系统发育分析：对碳水化合物活性酶（CAZymes）进行全基因组注释，并对FLA蛋白家族进行详细的系统发育分析以界定G层特异亚支。

研究结果

2.1 高分辨率取样跨越应拉木形成组织

研究人员对两株倾斜3周的TW树（t08和t11）和两株直立NW树（n05和n08）进行切向冷冻切片。细胞壁厚度测量显示，NW的细胞壁在约270 μm处均匀增厚后减缓至约500 μm，据此合并为3个样品。TW中细胞壁增厚延伸至约700 μm，且在距参考点约220–250 μm处出现对应于G层生物合成的急剧增厚加速。基于此，TW切片被合并为6个样品以覆盖所有细胞壁生物合成阶段。

2.2 早期转录相似性与阶段特异性重编程区分应拉木与正常木发育

PCA分析显示，前两个主成分分别解释40%和16%的总方差。NW生物学重复紧密聚集，而TW的t11样品与t08中距形成层稍远的样品聚集，表明两棵树之间存在发育偏移。研究人员据此将样品重新划分为发育同步的阶段N1–N3和T1–T7。TW与NW的转录组分离始于第三阶段（T3, N3），表明前两个发育阶段TW的转录组与NW相似。通过分析P层、S层和G层标记基因的表达谱，最终将样品分类为：N1–N3（NW S层生物合成），T1–T2（TW S层生物合成），T3（S/G层转换期，即早期G层形成），T4–T7（G层生物合成，即晚期G层生物合成）。

2.3 G层生物合成期间差异调控基因的鉴定

差异表达分析发现，G层早期和晚期共有2,898个DRGs，而NW中仅58个DRGs。这些DRGs被聚类为11个共表达组（I–XI）。早期G层上调基因（组II）富集于信号转导和蛋白质加工；下调基因（组I和III）富集于代谢。早期和晚期均上调的基因（组IV和VI）富集于纤维素、胼胝质和RG-I代谢、FLA蛋白和驱动蛋白相关基因。晚期G层特异上调的基因（组VIII和X）富集于胼胝质代谢、细胞分裂、微管和囊泡运输、锌指转录因子等。晚期下调基因（组IX和XI）富集于细胞壁多糖和木质素代谢、生长素和油菜素内酯激素响应等。

2.4 G层多糖生物合成相关基因的鉴定

2.4.1 G层形成期间CesA异构体使用和纤维素合酶复合物相关基因的重编程

在G层形成期间，次生壁CesA基因的表达发生分化，PtCesA8-B 的表达水平显著高于其他异构体。同时，多个初生壁CesA（如 PtCesA1A/B、PtCesA3C/D、PtCesA6B/C）在整个NW和TW形成过程中保持高表达，暗示初生壁纤维素合酶复合物可能也参与G层合成。与纤维素合酶复合物相关的辅助蛋白基因（如 CC、CSI、CMU）大多在G层发育期间被抑制。此外，PtCSLD8、PtCOBL4b、PtCHI-like29 等基因在G层形成中被诱导，可能是G层纤维素合成的关键组分。

2.4.2 G层果胶生物合成与修饰的新型候选调控因子

RG-I是G层中最丰富的基质多糖。PtRRT1-A/B、PtRGGAT1-A/B 在G层形成中特异上调，峰值出现在T5阶段，是G层RG-I骨架合成的候选基因。PtGALS2-A/B 编码RG-I半乳聚糖合酶，同样在T5达到峰值。一个GH35家族成员（Potri.002G080700）在T5瞬时高度上调，是G层β-1,4-半乳糖苷酶活性的首要候选基因。两个PL4家族的鼠李糖半乳糖醛酸裂解酶（Potri.006G253600 和 Potri.014G004500/PL4_4）也在G层生物合成中上调。这些基因可能共同调控G层的收缩特性。

2.4.3 G层特异性FLA12亚支的分类

通过系统发育分析，研究人员将FLA蛋白分为五个超支（C11A–C11E），其中C11A3亚支包含22个最接近 FLA12 的同源基因。在这些基因中，C11A3.1–3.3亚支的18个成员在G层形成期间显著上调，而C11A3.4亚支及其他FLA支系（如C11A1中的 FLA6/9/13、C11A2中的 FLA11）则被下调。这些G层诱导的 FLA12 同源基因多数位于染色体13和19上，部分为G层特异表达。

2.4.4 染色体14上胼胝质代谢基因簇的G层特异性诱导

GH17家族（胼胝质水解酶）中有13个成员在G层生物合成期间上调，其中11个聚集在染色体14上，且缺乏CBM43或GPI结构域。相比之下，GT48家族（胼胝质合酶）在NW和TW中稳定表达。四个含CBM43结构域的基因在G层形成中上调。结果表明，G层形成期间存在一套专用的胼胝质代谢机器。

2.4.5 半纤维素生物合成相关基因的表达

木葡聚糖方面，PtXTH5 在G层生物合成中特异诱导，而大多数其他XTH基因被抑制。木聚糖方面，虽然多数核心木聚糖合成酶基因表达稳定或下降，但 PtGUX4-A 和两个GT61家族成员在G层形成中被诱导，提示可能存在G层特异的葡萄糖醛酸阿拉伯木聚糖合成机制。甘露聚糖方面，PtCSLA1、PtCSLA3、PtCSLA4 的表达在G层形成中下降，而 PtMAN4、PtMAN6、PtMAN8 被诱导，可能参与G层形成。

2.4.6 未知功能的GT和GH候选基因

研究发现多个功能未知但在G层合成中上调的GT和GH基因，包括GT47家族B支的 PtGT47B-1（可能编码RG-I半乳聚糖起始酶GalTi）、GT2家族CSLG支的 PtCSLG4、GT14家族的 PtGT14_13、GT77家族的两个成员，以及GH31家族的两个成员，它们可能参与G层聚合物新型结构的生成。

2.4.7 高尔基体多糖生物合成的底物供应

核苷酸糖转运蛋白（NSTs）的表达模式与G层的多糖需求一致。UDP-鼠李糖/UDP-半乳糖转运蛋白（URGTs）的同源基因在G层形成中显著上调，而UDP-木糖转运蛋白（UXTs）的表达则下降，这与G层中RG-I和AG-II大量合成、木聚糖合成减少的趋势吻合。

2.5 木质素生物合成相关基因的表达

大多数木质素单体生物合成基因的表达在G层形成期间并未显著下降，而是持续存在。相反，许多漆酶编码基因（如 PtLAC2、PtLAC4、PtLAC11）和过氧化物酶编码基因（如 PtPRX39）在G层形成后期显著下调。这表明，相对于单体合成酶，木质素聚合酶（漆酶和过氧化物酶）在转录水平的调控更为严格，可能是控制G层低木质素含量的关键。

2.6 G层生物合成相关共表达模块的鉴定

通过层次聚类，22,363个表达基因被分为90个共表达簇，并根据表达模式归为四类：稳定表达簇、初级-次级壁转换期高表达簇、S层生物合成期诱导簇、G层生物合成期诱导簇。功能富集分析揭示了各簇参与的生物学过程，为后续功能验证提供了丰富靶点。

总结与讨论

本研究通过高空间分辨率的切向冷冻切片转录组学策略，首次系统描绘了杨树应拉木G层形成全过程的分子程序。研究人员成功将G层发育分为早期和晚期两个阶段，并鉴定出2,898个差异调控基因、90个共表达模块以及一系列G层特异的多糖合成酶、FLA蛋白、转录因子和激素调控基因。研究结论指出：G层形成涉及大规模的转录重编程，不同于S层沉积过程中的相对静态转录状态；G层纤维素合成依赖特定的CesA异构体（尤其是 PtCesA8-B）和辅助蛋白（如 PtCOBL4b）；RG-I及其半乳聚糖侧链的合成与修饰酶（如 PtRRT1-A/B、PtGALS2-A/B、Potri.002G080700）是G层收缩特性的关键决定因素；FLA12亚支（C11A3.1–3.3）是G层标志性蛋白；木质素聚合酶而非单体合成酶的转录下调是G层低木质素化的主要原因；30个非经典转录因子和多个激素通路基因构成G层分化的新型调控网络。该研究为理解木本植物收缩性细胞壁的生物合成、信号传导和进化提供了迄今最详尽的分子蓝图，并为利用G层特性进行纳米纤维素材料和智能材料的生物技术开发奠定了坚实基础。