基于透明质酸的可注射自愈合双响应水凝胶用于细胞外囊泡递送

《International Journal of Pharmaceutics》：An injectable, self-healing hyaluronic acid-based hydrogel as a dual-responsive depot for extracellular vesicle delivery

　　

可注射、自愈合的基于透明质酸的水凝胶作为细胞外囊泡递送的双响应储库。可注射、自愈合的透明质酸/聚乙二醇(HA/PEG)水凝胶能够实现间充质基质细胞来源的细胞外囊泡(MSC-EVs)的保留；pH和透明质酸酶(HAase)双响应降解触发细胞外囊泡(EVs)的释放；MSC-EVs在封装和水凝胶释放后保持结构完整。

细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs），尤其是人间充质基质细胞（human mesenchymal stromal cells, MSCs）来源的EVs，能够介导组织修复信号，具有再生治疗潜力。然而，EVs经静脉注射后会被单核吞噬系统快速清除，循环中24小时残留率仅约1%，导致靶部位有效浓度难以维持，常需反复给药，并可能引起外周器官脱靶效应。因此，生物材料辅助的EV递送策略成为研究热点。注射水凝胶凭借三维亲水网络和可调降解性能，可提高EV保留并实现可控释放。透明质酸（hyaluronic acid, HA）生物相容性好、临床应用广泛，但其机械强度有限且易被透明质酸酶（hyaluronidase, HAase）降解；与聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）复合可改善力学性能和释放行为。炎症和病理微环境常伴随pH降低和HAase活性升高，因此pH和酶双响应系统有望实现微环境触发的局部递送。然而，多数EV递送水凝胶依赖静态共价交联，可注射性和自愈合性不足；常见HA动态水凝胶采用氧化HA引入醛基，但氧化会降低HA分子量、破坏链构象并造成网络异质性。为此，研究人员设计了一种基于酰肼修饰HA（HA-ADH）和醛基化PEG（PEG-ALD）的动态酰腙键交联水凝胶，作为EV递送的双响应储库。

研究人员合成了HA-ADH与PEG-ALD，采用1H核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）和尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography, SEC）表征结构。将两种组分按不同醛基/酰肼摩尔比（R=CHO/NH2）混合，形成水凝胶并系统评价其理化性能、细胞相容性、EV封装与释放行为。主要技术方法包括：HA-ADH通过碳二亚胺化学偶联ADH合成，PEG-ALD通过酯化反应将醛基连接至PEG末端；水凝胶采用原位共混交联制备，以管倒置法测定凝胶化时间，并用目视法评估注射性；溶胀实验在pH 7.4和5.5的磷酸盐缓冲液中测定重量变化；水解和酶降解实验通过残余重量百分比评估降解速率；流变学测试使用旋转流变仪进行应变扫描、频率扫描、流动扫描和交替高低应变恢复实验；细胞相容性采用MTS比色法，包括间接、直接及三维（3D）封装培养；EVs从胎儿真皮间充质基质细胞（fetal dermal MSCs, FD-MSCs）培养上清中经差速超速离心分离，该细胞来源于胎儿皮肤活检（研究伦理委员会批准）；EV释放实验将EVs预封装入水凝胶，在含或不含HAase的PBS中孵育，通过Western blot检测CD81、原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）观察形态、Luminex技术定量蛋白货物。

### HA-ADH与PEG-ALD的合成与表征

1H NMR证实HA-ADH的ADH功能化程度为38.5±3 mol%，PEG-ALD的醛基功能化程度为86±3 mol%。SEC显示HA-ADH重均分子量（Mw）为459.9 kDa，多分散指数（PDI）为3.6，与天然HA（Mw 411.2 kDa，PDI 2.1）相近，说明酰肼修饰未破坏HA多糖骨架。

### 凝胶化时间与可注射性

通过管倒置法观测凝胶化时间，发现其高度依赖HA-ADH浓度。3%和2%（w/v）配方凝胶化极快但挤出需较大推力，注射性差；1%（w/v）配方在R=0.15、0.25和0.50时均于24小时内凝胶化，且只需最小挤出压力，具有良好的可注射性，因此后续研究选择1%（w/v）HA-ADH的三种摩尔比配方。

### 溶胀、水解和酶降解稳定性

pH 7.4时，R=0.15配方溶胀最快，