精确pH触发的PEG-脂质缀合物裂解驱动siRNA从融合脂质纳米颗粒中内体逃逸

《International Journal of Pharmaceutics》：Precise pH-triggered cleavage of PEG–lipid conjugates drives endosomal escape of siRNA from fusogenic lipid-based nanoparticles

　　

脂质纳米颗粒（lipid-based nanoparticles, LNPs）是体内功能性递送小干扰RNA（small interfering RNAs, siRNAs）和mRNA疫苗的主要合成递送系统。然而，当前最先进的LNPs虽然被设计为具有近乎最佳的融合性（fusogenicity），以实现靶细胞进入和RNA活性药物成分（RNA APIs）的释放，但由于制剂中聚乙二醇-脂质（polyethylene glycol-lipids, PEG-lipids）的使用有限，其胶体稳定性和生物相容性欠佳。研究人员在此通过新型pH触发的RNA-LNPs（ZK2 LNPs）克服了这一缺点，该LNPs包含5 mol%的PEG-脂质肟缀合物（PEG-lipid oxime conjugates），利用pH可逆的氨氧基-醛点击化学（aminoxy-aldehyde click chemistry）原位制备。通过质谱和电子显微镜分析，ZK2 LNPs在中性pH的PBS中显示胶体稳定，但在pH 7至6之间发生pH触发的PEG脱落（PEG-shedding），这源于PEG-脂质肟缀合物的水解裂解，以及pH敏感的脂质相变。这些温和酸诱导的理化变化似乎促进了ZK2 LNPs与内体模型细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）在pH值与早期内体pH变化（pH 6.8至6）相协调的条件下越来越有效的融合，从而解释了共聚焦显微镜研究中所观察到的ZK2 LNPs如何在通过内吞作用进入细胞后驱动内体裂解，然后将RNA释放到体外HepG2细胞的细胞质中。最后，ZK2 LNPs在慢性HBV（chronic HBV, CHB）感染的HepG2.2.15模型中介导了有效的功能性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）基因沉默，并在体内表现出优异的LNP耐受性。因此，ZK2 LNPs似乎具有独特的理化特性，可实现胶体稳定性、生物相容性、潜在隐身性（stealth）以及RNA API向靶细胞细胞质的高效递送，因此可能代表一种强大的下一代LNP技术。

基因治疗具有巨大潜力，但核酸类活性药物成分（API）因分子量高、带负电且易降解，需依赖递送载体进入靶细胞。脂质纳米颗粒（LNP）是体内功能性递送小干扰RNA（siRNA）和mRNA疫苗的前沿合成递送系统。当前最先进的RNA-LNP通常采用“ABC”结构范式，由可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和低比例（1.5–3 mol%）的PEG-脂质组成；低比例PEG-脂质是为了在体内快速脱落以促进靶细胞进入，但这也牺牲了胶体稳定性和生物相容性。因此，需要一种能够在保持足够表面PEG化的同时，仍能实现高效胞质递送的新设计。研究人员在此报道了pH触发的ZK2 LNPs，通过pH可逆的氨氧基-醛点击化学原位生成5 mol%的PEG-脂质肟缀合物。该LNP在中性pH下稳定，但在pH 6.8–6（早期内体pH范围）发生肟水解介导的PEG脱落和pH敏感脂质相变，从而驱动内体融合、裂解并释放siRNA。在慢性HBV感染的细胞模型中，ZK2 LNPs实现了有效且持久的HBV基因沉默，并在小鼠中表现出良好耐受性。该工作为下一代LNP平台提供了重要基础。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：乙醇稀释法制备含氨氧基锚定脂质CPA的脂质体，与siRNA复合后再通过pH可逆的氨氧基-醛点击化学偶联m-PEG₂₀₀₀-丙醛，形成ZK2 LNPs；对照ZKC LNPs使用pH稳定的m-PEG₂₀₀₀-DSPE。利用MALDI-TOF质谱、cryo-TEM和动态光散射表征pH依赖的PEG脱落与形态变化；建立基于牛乳来源细胞外囊泡（BMEVs）的单囊泡融合实验，结合EVAnalyzer定量；通过流式细胞术和共聚焦显微镜观察HepG2细胞摄取与siRNA释放；使用HepG2.2.15细胞模型（稳定表达HBV基因组）评价抗HBV siRNA的基因沉默效率，并在BALB/c小鼠中评估体内耐受性。

2.1 脂质合成与设计特征（Lipid synthesis and design features）：研究人员构建了包含三碱基可电离脂质DODAG 1和CDAN 2、辅助脂质DOPE 3和胆固醇4，以及氨氧基锚定脂质CPA 5、CA 6、CTA 7和PEG₂₀₀₀-醛配体8、9、10的工具包。通过合成与表征这些组分，为制备pH可逆点击偶联的LNP提供了材料基础。

2.2 使用EVAnalyzer和纳米颗粒跟踪分析的初始制剂研究（Initial formulations studies using EVAnalyzer and nanoparticle tracking analysis）：通过单颗粒成像和EVAnalyzer定量，研究人员观察到siRNA与脂质体的共定位效率随正负电荷比增加，并选择+/? 6:1 (m/m)作为最佳电荷比，此时纳米颗粒平均直径约130 nm，且胶体稳定性良好。

2.3 使用质谱、电子显微镜和动态光散射的LNP制剂研究（LNP formulation studies using mass spectrometry, electron microscopy and dynamic light scattering）：MALDI-TOF质谱显示ZK2 LNPs在中性pH下存在完整的PEG-脂质肟缀合物，而在pH降至6.5–6.0时游离PEG信号显著增加，表明肟水解和PEG脱落。cryo-TEM进一步显示，随pH降低，ZK2 LNPs由双层结构转变为表面关联和多层融合结构，而对照ZKC LNPs无此变化。

2.4 单囊泡成像的LNP机制研究——杂交体形成（LNP mechanistic studies with single vesicle imaging – hybridosome formation）：通过将Cy7标记的BMEVs与Cy5/AF488双标记的ZK2 LNPs在酸性pH下共孵育，单囊泡成像显示ZK2 LNPs在pH 6.5以下与BMEVs的共定位率显著增加，接近pH 6.0时达到近定量融合；对照ZKC LNPs则始终保持在约20%的基线水平。该结果表明pH触发的PEG脱落是驱动LNP-内体膜融合的关键机制。

2.5 流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜分析LNP细胞进入（Flow cytometry and confocal laser scanning microscopy analysis of LNP cell entry）：在HepG2细胞中，流式细胞术显示ZK2 LNPs的细胞摄取水平高于对照ZKC LNPs。共聚焦显微镜观察到，随时间延长，ZK2 LNPs处理的细胞中出现AF488-siRNA信号与Cy5-脂质信号分离，表明siRNA从LNPs释放至细胞质；而ZKC LNPs处理组中两种信号持续共定位，提示siRNA被困于晚期内体/溶酶体。

2.6 LNP介导的siRNA递送至肝细胞（LNP-mediated siRNA delivery to liver cells）：在HepG2.2.15细胞模型中，ZK2 LNPs递送抗HBV siRNA（1407及化学修饰的1407-ALN）后，HBV mRNA表达水平显著下降，且沉默效果持续至少6天，与Lipofectamine? RNAiMAX相当或更优；而对照ZKC LNPs几乎无沉默活性。CCK-8实验显示各制剂均无细胞毒性。BALB/c小鼠单次静脉注射ZK2 LNPs后，体重、器官重量及组织病理学均未见异常，表明体内耐受性良好。

讨论部分指出，当前最先进LNP依赖单碱基可电离脂质和低比例