《Neurochemical Research》：Lycium Barbarum Polysaccharides Alleviate Parkinson’s Disease-Induced Neurodegeneration by Up-Regulating USP10 to Modulate Endoplasmic Reticulum Stress
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内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）是帕金森病（Parkinson’s disease, PD）的重要病理机制，而持续的ERS最终可导致细胞凋亡。本研究旨在探讨枸杞多糖（Lycium barbarum polysac
内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）是帕金森病（Parkinson’s disease, PD）的重要病理机制，而持续的ERS最终可导致细胞凋亡。本研究旨在探讨枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides, LBP）对MPP?诱导的原代神经元损伤的神经保护作用。研究人员以MPP?处理小鼠原代多巴胺能神经元24 h建立PD细胞模型，随后给予LBP处理24 h。蛋白质印迹（Western blot）分析显示，与对照组相比，MPP?处理可诱导原代神经元发生ERS及凋亡，表现为ERS及凋亡标志蛋白GRP78、p-IRE1α、p-eIF2α、ATF-4、CHOP、Caspase-3及Bax表达上调，线粒体跨膜电位降低并促进活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生；而LBP处理可显著拮抗MPP?诱导的ERS及细胞凋亡。敲低泛素特异性蛋白酶10（ubiquitin-specific protease 10, USP10）可削弱LBP对MPP?损伤原代神经元的保护作用。免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）及免疫荧光共定位实验证实USP10与Yes相关蛋白1（Yes-associated protein 1, YAP1）之间存在相互作用。去泛素化实验表明，USP10可降低YAP1的泛素化水平并增强其蛋白稳定性。此外，研究人员证实USP10通过抑制YAP1泛素化，进而抑制促ERS关键通路PERK/eIF2α/ATF-4/CHOP，从而减轻MPP?诱导的ERS及细胞凋亡。综上，研究结果表明LBP通过促进USP10介导的YAP1去泛素化，进而抑制PERK/eIF2α/ATF-4/CHOP信号通路，减轻MPP?诱导的神经元损伤，该发现为帕金森病的发病机制研究提供了新见解，也为枸杞多糖的药理机制及作用靶点提供了潜在依据。
**一、研究背景与科学问题**
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是第二大常见的神经退行性疾病，其病理特征为中脑黑质及纹状体多巴胺能（dopaminergic, DA）神经元选择性丢失，以及α-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）错误折叠聚集形成路易小体（Lewy bodies, LB）。流行病学预测显示，到2050年全球PD患者将达2520万，较2021年增长112%。目前PD的治疗手段包括药物治疗、手术及基因治疗等，但现有方案疗效有限。研究表明多种中药具有抗氧化、抗炎及镇痛等生物学活性，对PD等神经系统疾病具有显著治疗作用。因此，探索中药治疗PD的作用机制具有重要意义。
内质网（endoplasmic reticulum, ER）是蛋白质修饰、折叠、分泌及钙稳态维持的关键细胞器。当ER内蛋白折叠错误或异常聚集时，会激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）。UPR无法维持蛋白稳态时，细胞进入凋亡程序，导致神经功能障碍。研究表明，内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）深度参与PD发病过程，并与线粒体功能障碍、氧化应激及神经炎症相互作用，加剧DA神经元损伤。动物及临床前实验提示，ERS是PD治疗的有前景的靶点。
枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides, LBP）是从中药枸杞中提取的主要活性成分，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎及抗衰老等功能。已有研究表明LBP在实验性PD小鼠模型中可通过抑制促氧化应激通路Nrf2-HO-1、改善多巴胺代谢或激活PTEN/AKT/mTOR自噬通路发挥预防作用，但其缓解神经毒性及氧化应激的深层机制，尤其是亚细胞器靶点仍不明确。
泛素化是一种可逆的翻译后修饰，去泛素化酶可切割并去除底物蛋白上的泛素链。泛素特异性蛋白酶10（ubiquitin-specific protease 10, USP10）是泛素特异性蛋白酶家族的关键成员，可通过去泛素化抑制泛素-蛋白酶体降解途径，维持蛋白稳定性，改善脑缺血再灌注后的神经损伤。然而，USP10是否通过调节蛋白泛素化及ERS影响PD神经损伤尚不清楚。基于上述背景，研究人员提出科学假说：LBP通过上调USP10，抑制YAP1蛋白的泛素-蛋白酶体介导降解，进而调控PERK/eIF2α/ATF-4/CHOP信号通路，缓解ERS，发挥神经保护作用。
**二、研究设计与技术方法**
该研究以新生C57BL/6小鼠（5雄5雌，14日龄）分离的原代神经元为研究对象，采用1 mmol/L MPP?处理24 h建立PD细胞模型，随后给予200 μmol/mL LBP处理24 h。主要关键技术方法包括：蛋白质印迹（Western blot）检测ERS及凋亡相关蛋白表达；CCK-8法检测细胞活力；流式细胞术检测细胞凋亡率、线粒体膜电位（ΔΨm）及ROS水平；荧光钙探针检测胞内钙离子浓度；透射电子显微镜观察ER超微结构；免疫共沉淀（Co-IP）及免疫荧光共定位验证蛋白相互作用；体外泛素化实验检测YAP1泛素化水平；siRNA敲低及质粒过表达技术进行基因功能研究；使用PERK通路抑制剂GSK2606414进行通路验证。
**三、主要研究结果**
**1. LBP减轻MPP?诱导的原代神经元损伤**
CCK-8检测显示，1 mmol/L MPP?诱导约50%细胞死亡，200 μmol/mL LBP对MPP?诱导的细胞活力下降及凋亡具有最显著的改善作用，故后续实验采用该浓度。
**2. LBP缓解MPP?诱导的原代神经元ERS及凋亡**
Western blot结果显示，MPP?单独处理显著上调GRP78、p-IRE1α、p-eIF2α及CHOP蛋白表达；LBP可抑制GRP78、p-eIF2α和CHOP的上调，但对p-IRE1α无显著影响。电镜观察显示MPP?组ER明显肿胀空泡化，LBP共处理显著改善ER超微结构改变。钙荧光探针显示LBP显著降低MPP?诱导的胞内Ca2?升高。此外，LBP逆转了MPP?诱导的促凋亡蛋白Caspase-3和Bax上调及抗凋亡蛋白Bcl-2下调，降低ROS水平并恢复线粒体膜电位。
**3. USP10敲低削弱LBP的保护作用**
MPP?处理显著降低USP10表达，LBP处理则恢复USP10水平。siRNA敲低USP10后，LBP对细胞活力的保护作用被消除，ERS相关蛋白（GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF-4、CHOP）表达升高，胞内Ca2?水平增加，凋亡蛋白表达上调，ROS累积增加。USP10过表达载体可完全逆转si-USP10#3的作用，排除了siRNA脱靶效应。
**4. USP10过表达缓解MPP?诱导的神经毒性**
过表达USP10显著提高MPP?处理后细胞活力，降低ERS相关蛋白表达，减少胞内Ca2?和ROS水平，抑制凋亡蛋白表达，表明USP10过表达可减轻MPP?诱导的ERS及细胞凋亡。
**5. USP10通过去泛素化YAP1缓解MPP?诱导的ERS及凋亡**
Co-IP实验证实USP10与YAP1存在特异性相互作用，免疫荧光显示两者在细胞质中共定位。体外泛素化实验表明USP10过表达降低YAP1泛素化水平，而USP10敲低增强YAP1泛素化。功能实验显示，在MPP?处理条件下，USP10与YAP1共过表达较单独过表达USP10进一步增加YAP1蛋白表达和细胞活力，进一步降低ERS相关蛋白表达及细胞凋亡率。
**6. YAP1通过抑制PERK/eIF2α/ATF-4/CHOP通路减轻MPP?诱导的ERS及凋亡**
YAP1敲低进一步加剧MPP?诱导的细胞活力下降，上调p-PERK、p-eIF2α、ATF-4和CHOP蛋白表达，促进凋亡。PERK通路抑制剂GSK2606414（1.5 μmol/L）显著逆转YAP1敲低导致的细胞活力下降、ERS及凋亡相关蛋白变化及凋亡率升高，同时不影响USP10和YAP1本身表达，证实YAP1通过抑制PERK/eIF2α/ATF-4/CHOP通路发挥作用。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出，MPP?处理诱导神经元显著ERS，表现为ERS相关蛋白上调、ER肿胀空泡化及胞内钙水平升高，同时伴随凋亡、ROS累积和线粒体功能障碍。LBP通过特异性调控PERK通路（而非IRE1通路）发挥神经保护作用。USP10作为去泛素化酶，其上调增强LBP的保护效应，敲低则消除该保护作用。YAP1作为Hippo通路的效应因子，其过表达增强USP10的抑制效果，敲低则通过激活PERK通路削弱USP10的神经保护作用。GSK2606414逆转YAP1敲低导致的促凋亡效应，进一步证实YAP1通过抑制PERK通路介导保护作用。
研究结论表明，LBP通过上调去泛素化酶USP10减轻MPP?诱导的ERS和细胞凋亡。其机制为USP10抑制YAP1泛素化，进而抑制PERK/eIF2α/ATF-4/CHOP信号通路激活，最终缓解ERS并促进细胞存活。该发现为PD的基础研究及天然治疗产品的开发提供了实验依据。
本研究存在两方面局限性：其一，缺乏动物水平的体内实验证据，削弱了结论的完整性；其二，由于LBP成分和结构的复杂性，LBP具体结合或靶向何种分子以调控USP10及ERS尚未明确。
