比较1H-NMR谱分析的长颈鹿与白犀牛血浆和血清代谢物特征

《Metabolomics》：Comparative 1H-NMR profiling of plasma and serum metabolites in giraffes and white rhinoceroses

　　

背景：血液代谢物谱可为野生动物生理变异提供描述性信息，但其解读受采样设计、样本基质和分析批次影响。目的：表征表观健康长颈鹿和白犀牛中可定量的血液代谢物，检查每个物种内与性别相关的差异，并进行一项探索性的基质匹配种间比较。方法：可获得24次有效长颈鹿采样事件（来自19只动物）和45只白犀牛的氢-1核磁共振（¹H-NMR）谱。代谢物从原始谱中联合定量。设计定义的比较采用log₂转换浓度、Welch检验、Benjamini–Hochberg假发现率（FDR）校正、效应量以及置换、基于秩、留一法和注释置信度敏感性分析。结果：在2017年Rooipoort长颈鹿血清样本中未检测到与性别相关的代谢物差异。9种代谢物在犀牛性别比较中达到主要假发现率标准，但仅N-乙酰葡糖胺在所有敏感性分析中持续显示强证据。在6份已验证长颈鹿和45份犀牛EDTA血浆样本的比较中，50种代谢物中有36种经主要分析存在差异；28种构成保守核心，得到所有统计检验和所有留一长颈鹿分析的支持。校正性别后该核心仍显著。采集年份与长颈鹿中血清对血浆完全混杂，未进行推断性检验。结论：两个研究组的血浆代谢物谱测量值显著不同，支链氨基酸相关代谢物之间存在一致差异。然而，物种与NMR采集批次不可分离，且长颈鹿组较小限制了生物学和通路水平推断。这些浓度提供探索性基线数据，而非正式参考区间。

循环代谢物整合多个器官的贡献，可反映遗传背景、生理状态、营养、微生物、外源物暴露和疾病。野生动物代谢组学数据仍相对匮乏，已有研究报道猎豹、大熊猫、非洲草原象、黑犀和苏门答腊犀牛等物种的基线数据，但代谢物浓度受性别、健康、饮食、管理和分析方法影响。长颈鹿（Giraffa camelopardalis）与白犀牛（Ceratotherium simum）是消化策略不同的大型草食动物，前者为前肠发酵的反刍浏览器，后者为后肠发酵的食草动物，因此血液代谢谱可能因物种生理、饮食和微生物发酵而不同。此前缺乏对这两种动物的基质匹配、设计定义的代谢物比较研究，且物种与采集批次混杂的干扰尚未被充分讨论。为此，研究人员利用已有的氢-1核磁共振（¹H-NMR）谱，描述表观健康长颈鹿和白犀牛的定量血液代谢物，检验物种内性别差异，并用乙二胺四乙酸（EDTA）血浆进行探索性种间比较。

研究队列包括来自南非北开普省同一半广袤野生动物园区2019年5月采集的45只白犀牛EDTA血浆，以及来自Rooipoort和Sandveld自然保护区2017年血清（18次）和2018年EDTA血浆（6次）的19只长颈鹿（24次有效采样）。关键技术方法包括：Bruker Avance III HD 500 MHz谱仪采集一维¹H-NMR谱，并用物种特异性J-分解谱（JRES）和化学位移相关谱（COSY）辅助注释；所有原始谱于2024年11月用AMIX 3.9.14联合再处理和定量，代谢物归属按代谢组学标准倡议（MSI）分为1级和2级；统计分析以log₂转换浓度、Welch检验、Benjamini–Hochberg假发现率（FDR）校正为主要方法，并辅以置换检验、Mann–Whitney检验、留一法及注释置信度敏感性分析。种间比较只纳入基质匹配的6份2018年长颈鹿EDTA血浆和45份犀牛EDTA血浆，共50种直接可比代谢物。

数据整理与代谢物覆盖：经排除重复分析记录F7B和无法核实身份的BM4后，最终数据集为24次长颈鹿采样和45份犀牛血浆。扣除Ca-EDTA和Mg-EDTA技术信号后，共表征54种生物代谢物；胆酸、甘氨胆酸和N,N-二甲基甲酰胺在长颈鹿中均未检出，N,N-二甲基甘氨酸未纳入犀牛浓度表。

长颈鹿性别比较：利用2017年Rooipoort血清（10雌6雄），46种代谢物可测。Welch检验未发现任何代谢物在未校正0.05水平有差异，最小p值为3-羟基异丁酸（雌/雄倍数变化1.26，p=0.070，q=0.895）；学生化置换检验同样无FDR显著代谢物。排除F6和F8、替换F7B或加入Sandveld两雌性后结论不变。因此未检出性别相关差异，但不能解释为两性代谢等价。

长颈鹿采集年份与样本基质：2017年样本为血清，2018年为EDTA血浆，年份与基质完全混杂，故未做推断性比较或通路富集分析。Ca-EDTA、Mg-EDTA、甲胺、二甲胺、肌氨酸和三甲胺在全部18份血清中未检出但在6份血浆中检出，天冬氨酸在3/18血清和6/6血浆中检出，这些非检测模式仅作描述性记录。

白犀牛性别比较：53种生物代谢物中9种经Welch-FDR主要标准显著：雌性白犀牛的N-乙酰葡糖胺、肌酐、丙氨酸、胆酸、甘氨胆酸、乙酰乙酸、异亮氨酸和缬氨酸较高，尿囊素较低。但稳健性不一：仅N-乙酰葡糖胺在所有检验和45次留一分析中持续显著；丙氨酸和肌酐在置换检验和多数留一分析中支持中等；其余6种接近FDR阈值，属阈值敏感。等方差t检验给出11种FDR显著，而仅限28种MSI 1级代谢物时保留N-乙酰葡糖胺和丙氨酸。

基质匹配的种间比较：6份长颈鹿与45份犀牛EDTA血浆直接比较50种代谢物。Welch-FDR显著36种，置换检验通过36种，Mann–Whitney通过34种，6次留一长颈鹿分析均显著29种；交集构成28种保守核心（含15种MSI 1级）。长颈鹿血浆较高的有丙酮酸（倍数2.60）、甘氨酸（1.98）、尿囊素（1.78）和三甲胺（1.50）；较低的有甲醇（0.20）、N-乙酰葡糖胺（0.20）、乙酸（0.26）、3-羟基异戊酸（0.35）、3-甲基-2-氧代戊酸（0.41）和甲胺（0.48）。性别校正后36种中34种仍显著，保守核心全部显著；富马酸和肌酸未保持。由于物种与采集批次完全混杂，这些结果描述两组差异而非纯生物学差异。

讨论部分指出三个主要发现：长颈鹿血清性别比较无显著差异，但样本量小，不能作为等价证据；白犀牛性别比较仅N-乙酰葡糖胺具备强稳健性，丙氨酸和肌酐中等支持，其余结果靠近FDR边界，应谨慎报告；基质匹配的种间比较显示大量代谢物差异，其中最一致的生物化学模式为支链氨基酸（BCAA）相关代谢物，长颈鹿血浆中亮氨酸、2-氧代异己酸、3-甲基-2-氧代戊酸、3-羟基异丁酸和3-羟基异戊酸较低，缬氨酸也较低但属敏感依赖性。该方向一致性与循环支链氨基酸谱或其分解产物差异相符，但无法区分摄入、瘤胃或后肠微生物代谢、组织利用、清除、禁食状态或分析批次。其他差异如丙酮酸高而柠檬酸低、乙酸盐和丙酸盐低，以及三甲胺高而甲胺/二甲胺低，无法简化为单一通路解释。非检测结果不能视为定量种间差异。研究限制包括仅6份长颈鹿血浆、不同种群/年份/生态背景、性别比例不同，以及所有长颈鹿和犀牛谱分别在不同批次采集且无共享质控。浓度数据仅作为探索性基线，不构成正式临床参考区间。结论：未在设计相容的长颈鹿血清比较中检测到性别相关差异。在白犀牛性别比较中，9种代谢物达到主要标准，但仅N-乙酰葡糖胺在所有敏感性分析中持续得到支持。基质匹配的长颈鹿和白犀牛研究组在50种定量代谢物中有36种存在差异，保守核心为28种，支链氨基酸相关化合物之间存在一致模式。这些发现支持进一步靶向比较研究，但由于物种仍与NMR采集批次混杂，不能确立通路激活或物种特异性机制。